由于测序仪机器读长的限制，建库过程中需要先对DNA进行片段化，测序得到的序列只是基因组的部分序列。 为了确定测序读数在基因组上的位置，需要将读数与参考基因组进行比较。 这一步称为。

进行时，需要考虑以下因素

1、硬件资源消耗

一般来说，基因组越大，占用的内存就越多。 对于大型基因组，例如人类基因组，优化内存消耗至关重要。

2、运行速度

随着测序价格的下降以及数据深度挖掘的需要，测序量不断增加，海量测序reads的比对必须足够快。

3. 准确度

SNP/indel、测序错误率等因素会导致测序的reads与基因组上的原始序列之间存在几个bp的错误，因此算法必须支持碱基错配或缺口的存在。 同时，由于测序的短序列可能与基因组上的多个位置同源，因此一次读取将与基因组上的多个位置进行比较。 双端测序技术可以在一定程度上纠正多个位置，因为双端读段来自同一个DNA片段，并且基因组上的两个位置相距并不算太远，但仅凭这一点并不能解决所有同源比。 是的，这需要比对算法对多个位置进行判断和打分，才能给出比对结果的可靠性。

4.RNA

对于转录组数据来说，真核生物中选择性剪接的存在导致cDNA片段在基因组上不连续，中间可能存在内含子。 比较转录组数据时，需要考虑跳过的剪接位点。

目前可用的工具有很多，比如bwa、hisat、star等，hisat是其中速度最快的，并且是软件的升级版本。 采用改进的FM索引算法，人类基因组仅需要约4.3GB内存。还支持DNA和RNA数据的比较。 该软件的官方网站如下：

目前最新版本是。 安装过程如下

wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip
unzip hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip

只需下载并解压即可。

在进行比较之前，首先需要对参考基因组进行索引。 基本用法如下

hisat2-build -p 20   hg19.fa hg19

对于转录组数据，构建索引时，可以通过gtf文件获取剪接位点和外显子信息。 用法如下

hisat2_extract_splice_sites.py hg19.gtf > hg19.ss
hisat2_extract_exons.py hg19.gtf > hg19.exon
hisat2-build -p 20  --ss hg19.ss --exon hg19.exon  hg19.fa hg19

支持多种格式的输入文件。 常见的格式有以下两种

法斯塔

快q

-f参数表示输入文件格式为fasta，-q参数表示输入文件格式为fastq。 输入文件可以是gzip压缩文件，默认输入文件是fastq格式。

对于单端数据，使用-U指定输入文件； 对于双端数据dnastar序列比对，使用-1和-2分别指定R1端和R2端的输入文件。

读取被映射到基因组上的一个位置，我们称之为“1”。 软件会对所有项目进行评分和判断，符合筛选条件的为有效。 仅输出有效的项目。

与爆炸类似，每一种也都有相应的评分机制。 hisat从以下几个方面进行评分：

1. 不匹配基数惩罚

碱基不匹配的惩罚是通过 --mp 参数指定的。 它的值是两个用逗号分隔的数字。 第一个数字是最高处罚，第二个数字是最低处罚。

2. 读取时的间隙惩罚

空位惩罚分为两部分，第一次出现空位的惩罚和空位扩展的惩罚。 读取时的间隙惩罚通过 --rdg 参数指定。 它的值是两个用逗号分隔的数字。 第一个数字是对空位第一个位置的罚分，第二个数字是对空位扩展的罚分。

3. 间隙罚分

间隙惩罚是通过 --rdg 参数指定的。 它的值是两个用逗号分隔的数字。 第一个数字是对空位第一个位置的罚分，第二个数字是对空位扩展的罚分。

经过一系列的惩罚机制后，每一个都会有相应的分数，然后用一个阈值来判断这个分数是否符合有效的要求。

hisat 通过 --score--min 参数指定阈值。 指定方法是与读取程度相关的函数。 默认值为L,0,-0.2，对应函数为

f(x) = 0 - 0.2 * x

根据阅读长度，可以计算分数阈值。 那些大于阈值的被认为是有效的并且可以被输出。 L表示线性函数。 此外，它还支持其他类型的函数，例如常量、自然对数等dnastar序列比对，更多选择请参考官方文档。

一次读取可能有多个有效值。 输出时，并不是全部输出，而是只输出-k参数指定的N。 -k 参数的默认值为 5。

输出结果以SAM格式保存，默认输出到屏幕。 可以通过-S参数指定输出文件。

通常情况下，默认参数就可以满足我们的需求。单端数据比较的用法如下：

hisat -x hg19 -p 20 -U reads.fq -S align.sam

双端数据的用法如下

hisat -x hg19 -p 20 -1 R1.fq -2 R2.fq -S align.sam

·结尾·

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