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本期我们将讲述如何进行甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP-seq/m6A-seq）实验，详细介绍其技术原理、文库构建和测序流程、信息分析流程和研究常规。

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甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

测序技术原理

表观转录组是指对RNA进行化学修饰，在不改变RNA序列的情况下调节基因表达的现象。 细胞内RNA存在100多种修饰，其中大多数表观遗传修饰发生在tRNA和其他非编码RNA上[1]。 mRNA的修饰无论是类型还是数量都相对较小。 下图显示了真核 mRNA 上发生的一些化学修饰[2]：

图1：mRNA甲基化修饰示意图

mRNA 上最丰富的修饰是腺苷酸 N6 位点的甲基化修饰（N6-、m6A）。 m6A 参与 mRNA 生命周期的各个方面 [2]。 m6A 修饰主要发生在 RRACH 等基序上（R = G 或 A，H = A、C 或 U）。 这类基序主要富集在终止密码子和3'UTR处，即m6A主要出现在终止密码子处。 sub 和 3'UTR 附近。 m6A 修饰由 m6A 甲基转移酶 () 催化，由 m6A 去甲基酶 () 去除，并由 m6A 结合蛋白 () 识别并发挥作用 [3]。 m6A修饰广泛存在于多种生物体中，包括病毒、酵母等高等动物、植物和人类[1,3]。

研究表明，m6A已知的主要功能是调节mRNA的稳定性：细胞质中m6A修饰的mRNA可以被识别并富集到体内（P-body），加速mRNA的降解。 此外，m6A修饰还可以改变RNA的二级结构，调节靶标识别，从而调节mRNA的稳定性。 在细胞核中，m6A修饰可以调节RNA剪接和核输出过程，从而调节基因表达。 m6A 也可能与 DNA 甲基化相互作用。 下图展示了目前已知的一些m6A与生物功能之间的关系：

图2：m⁶A和生物学功能

早期的实验方法已鉴定出rRNA和mRNA中m6A的存在，但由于实验技术的限制，m6A的研究一直没有重大进展。 近年来，RNA去甲基酶FTO的报道，使m6A修饰的研究再次进入人们的视野。 随后MeRIP-seq/m6A-seq实验方法的建立，为深入研究该修饰的分布和功能提供了机会[1]。

MeRIP-seq/m6A-seq 技术用于识别基因组中具有 m6A 修饰的区域。 其原理是通过特异性识别m6A修饰的抗体，在细胞内对带有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀。 通过对沉淀的RNA片段进行高通量测序并将其与生物信息学分析相结合，可以系统地研究整个基因组中m6A修饰的状态。 MeRIP-seq/m6A-seq是目前研究m6A修饰最广泛使用的技术之一。

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甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

实验过程

从样本处理到最终数据采集的每一步都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量将直接影响后续信息分析的结果。 为了从源头上保证测序数据的准确性和可靠性，样本处理、建库、测序的每一个步骤都必须严格控制，从根本上保证高质量数据的输出。 流程图如下：

(1)总RNA样本检测

RNA样本的检测主要包括三种方法：

(1)琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度及是否有污染，检测到明显的18S或28S主带，条带清晰；

（2）Qubit 2.0精确定量RNA浓度，检测到的总RNA总量不低于10ug；

（3）2100准确检测RNA的完整性，RIN值不低于7.5。

（二）图书馆建设

1.RNA片段化：

取10ug总RNA，加入RNA（），70℃反应10分钟，将RNA断裂成片段大小约为100nt的片段。 使用乙醇法沉淀片段化的RNA。

2. m6A富集：

用 IP（150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.5）洗涤含有 A 和 G 的磁珠，然后与 5 ug m6A 抗体 () 4°C 孵育 2h； 用IP洗涤两次，然后用IP去除磁珠。 重悬，加入片段化RNA，4℃翻转4小时； 4°C IP 洗涤磁珠 3 次，然后使用 m6A 竞争性洗脱液，4°C 孵育 1 小时。 将含有洗脱的m6A RNA的上清液收集到新试管中并用苯酚:氯仿:异戊醇(125:24:1)纯化。

3、图书馆建设：

使用® Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input User按照说明进行IP和Input样本的反转录和文库构建； 使用XP珠进行片段大小选择以获得最终的文库。

施工示意图如下：

图3：富集流程示意图

(3)文库质量检查

建库完成后，使用.0进行初步定量，将文库稀释至1ng/ul，然后使用2100检测文库大小。 大小达到预期后，使用qPCR方法准确定量文库有效浓度（文库有效浓度>2nM），确保文库质量。

(4) 机上排序

文库测试合格后，将根据有效浓度和目标机外数据量要求，在Nova平台上对不同的文库进行排序。 测序策略为PE150。

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甲基化 RNA 免疫共沉淀 (MeRIP-seq/m6A-seq)

信息分析过程

(1)原始离线数据的质量控制

原始离线数据为FASTQ格式，这是高通量测序的标准格式。 FASTQ 文件中的每四行是一个单元dnastar拼接序列，包含有关测序序列（读取）的信息。 单元第一行是读取的ID，通常以@符号开头； 第二行是测序序列，即reads的序列； 第三行通常是+号，或者与第一行相同的信息； 第四行是碱基质量值，描述了序列第二行中碱基的准确性。 一个碱基对应一个碱基质量值，因此这一行和第二行的长度相同。 以下是已读消息的示例：

图 4：FASTQ 格式示例

原始离线数据包含文库构建过程中引入的接头序列和低质量碱基。 这些因素会导致随后与基因组进行比较的读数较少，从而导致信息较少，因此需要进行过滤。 使用软件对原始数据执行质量控制步骤，例如去除适配器序列和低质量碱基。 使用的参数为： :MeRIP-PE.fa:2:30:10:1:true :30:15 :15 :15 :15 : 30

(2)数据对比

过滤后的数据需要与参考基因组进行比较。 基因组上发生m6A修饰的片段会有大量的reads比较形成“峰”。 根据峰的位置，可以确定 m6A 修饰发生在基因组中的哪个位置。 根据。

使用[4]进行对齐。 该软件可以快速将短序列与参考基因组比对，并且可以考虑和处理剪接位点，特别适合RNA数据的比对。 使用的参数是默认参数。 比对完成后，对结果路径进行过滤，去除多次比对和低质量比对，以获得更准确的比对结果。

(3) m6A修饰区域的检测

MeRIP-seq 富集 RNA 上的 m6A 修饰区域，然后进行测序。 因此，在m6A修饰的区域中，IP文库覆盖的reads数量会明显高于输入文库，从而形成“峰值”。 检测这些峰的位置可以确定 RNA 上发生 m6A 修饰的位置。

在识别出m6A修饰后，可以对m6A修饰进行分析，例如注释、分布统计和基序识别。

(4)差异m6A修饰区域的鉴定

使用 R 包进行差异 m6A 修饰（即差异峰）的识别 [5,6]。 这个R包首先合并需要比较的样本的peak，然后计算每个样本合并的peak中的累计reads数； 然后对这些reads进行标准化，使两组样本处于可比较的水平； 最后对两组进行测试。 峰内样本之间的reads数量是否存在显着差异。 使用的参数为： =200 =30 HANGE = 1.5 =1.5 =200。

在识别差异性 m6A 修饰后，可以对差异性 m6A 修饰进行分析，例如注释、分布统计和基序识别。

(5) mRNA基因表达水平分析

m6A-seq的输入文库相当于RNA-seq文库dnastar拼接序列，可用于分析基因表达，识别差异表达基因。 通过对映射到基因组区域或基因外显子区域的测序序列（读数）进行计数来估计基因表达水平。 读取计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度正相关。 为了使不同基因、不同实验之间计算的基因表达水平具有可比性，使用TPM对reads数量进行标准化。 该算法考虑了测序深度和基因长度对计数的影响。 它是目前计算基因表达水平最常用的方法。 一。

图5：TPM计算公式 注：Ri代表基因的数； Li代表基因的长度（kbp），选择最长的转录本作为基因的长度。 表达量计算软件为[7]，使用默认参数，使用TPM显示基因表达量。

(6) 筛选、鉴定及表达量计算

通过组装转录本，可以发现注释文件之外的新转录本。 这些新转录本在一系列严格条件下进行筛选，并鉴定出非编码 RNA。

（1）使用软件[7]组装转录本，获取每个样本中的所有转录本，并将注释文件中未出现的转录本标记为新转录本。 新转录本的过滤条件为： a) 对于每个样本的组装注释文件，过滤掉外显子号 >= 2 但 FPKM=1 但 FPKM 的转录本

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