微生物种类繁多，诸如真菌、病毒等，只要它们具备一个参考基因组，便可以进行序列对比分析dnastar序列比对，进而识别出与参考基因组存在差异的部位，这些差异点就是我们所说的变异位点。

以近三年来肆虐的SARS-CoV-2病毒为研究对象，在《Acute – 2 in With 2019》一文中dnastar序列比对，详细阐述了通过DNA测序寻找变异位点的具体流程，其中主要涉及四个软件，具体步骤如下所示：

这四个阶段，对于所使用的软件种类并无特定要求，比对分析可选择BWA等工具，处理PCR重复数据的软件也有十几款，而后续变异检测同样有多种选择，实际上，将这些步骤整合到一个脚本中即可。

使用samtools的mpileup功能，结合ref.fasta作为参考序列，对test.bam文件进行处理；然后通过bcftools的call命令，以-vmO z的参数设置，将结果输出为压缩格式的test.bcftools.vcf.gz文件。

如果要理解上面的命令，就需要自己去看一些软件的文档：

然而，仅是确定变异位点，这只是ngs数据分析的初步阶段，面对庞大的参考基因组，需关注各基因功能区域的变化，以及这些突变是否具有生物学上的重要性。特别是对于微生物，面对成千上万个测序数据，我们更关注的是群体层面的概念：

整体查看突变

若涉及人类DNA或RNA的测序资料，需进行变异搜寻，一般采用GATK流程。在处理过程中，前期的bam文件会依据所使用的比对工具而定。一旦获得bam文件，例如在进行STAR软件对RNA-seq数据的比对后，便需遵循以下步骤：

sambamba markdup -
$gatk SplitNCigarReads -
$gatk SplitNCigarReads 
$gatk AddOrReplaceReadGroups  
$gatk   HaplotypeCaller 

如果是肿瘤DNA测序数据找变异，通常是突变，流程是：

参考书目：《关于该地点现场的研究报告》

学徒作业

获取SARS-CoV-2的测序数据后，挑选出一段序列，对其进行质量控制，接着对reads进行处理，随后进行比对分析，再去除PCR重复序列，最终确定变异位点。

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