浅谈引物设计中的Tm值

写在前面的

近期，我投身于分子生物学实验项目的实践，对湿实验的细节逐渐有了深入的认识和理解。在上一期的推送中，我简要探讨了对于PCR引物设计中吉布斯自由能变化ΔG的理解。那时，我初步掌握了如何评估引物与模板结合力的强弱。现在，本期的推送将延续这一主题，继续记录我在PCR学习中关于引物退火温度Tm值的感悟与理解。同样，这一次的推送我也将继续参入科学哲学的相关视角或思想。

关于Tm值的背景

依据分子生物学或生物化学教材中提供的定义，Tm值指的是在两段互补的碱基序列中，当解链达到50%时所处的温度。在英文中，对（Tm）的定义也大体如此：它是50%的DNA从双链状态转变为单链状态时的温度。Tm值受到GC碱基对的影响。在英文名称的解释中，特别指出DNA的Tm值主要取决于其序列中GC含量的多少。这是因为碱基互补配对过程中，A与T的结合会产生两个氢键，而C与G的结合则会形成三个氢键。

图1.碱基互补配对模式图

如何计算引物的Tm值

实际上，当我接触到Tm值的相关知识后，我曾努力探究过Tm值的计算方法，却发现大部分资料都推荐使用特定软件或工具。罕见的是，能从公式原理出发进行解答的资料。于是，我重新开始了对古老文献的深入研究。在此，我忍不住要发表一番感慨：尽管生命科学是一门以实验为核心的自然科学，但这并不意味着从事生命科学研究只需掌握软件操作技能即可。众多基础生物学议题仍需从根本处进行深入探究。若一切皆以拿来主义为准则，生命科学领域的未来发展将面临严重困境。

回到讨论的核心。在计算引物的熔解温度（Tm值）方面，目前存在超过三十种不同的计算公式。其中，最基本的方程式是：

nG/nC/nA/nT: 每种碱基的个数

该方程仅分析了引物碱基序列对Tm值的作用。依照Tm值的定义，DNA解链至50%时的温度即为Tm值。然而，实际上，当DNA解链至50%时，环境因素如盐离子浓度以及DNA自身的结构是否会对解链过程产生影响？若存在影响，那么实际DNA解链至50%时的温度与通过方程式计算得到的温度将存在显著差异。鉴于上述种种因素，从事DNA热力学研究的学者们早期便开展了众多理论和实验方面的探索。于是，针对引物Tm值计算的邻近二态模型应运而生dnastar引物设计，进而导出了第二个公式：

∆H/∆S: 焓变/熵变
R: 摩尔气体常数
C: 寡核苷酸的浓度
常数项: 绝对0度，也叫零开尔文

在上述方程里，焓变和熵变均被视为热力学中的状态函数，这一点在先前关于吉布斯自由能变化的计算中已有提及。而在后续的实验中，研究人员还观察到体系内钠离子浓度的变化对DNA的解链程度产生了影响。基于这些发现，我们可以推导出以下公式。

通常情况下，DNA退火温度的预测主要依据经验数值，并采用以下计算方法：

Length: DNA长度

在Tm值预测公式被提出之后dnastar引物设计，分子生物学家在众多实验中观察到，实际退火温度与预测的Tm值之间往往存在一定程度的偏差。这些偏差与先前预估的Tm值之间存在某种关联。鉴于此，科学家们提出，或许可以构建一个最佳退火温度的预测模型，以便通过引物的退火温度来准确设定实际实验中的退火温度。

Ta (opt): 预计的最佳实验退火温度

上述内容仅涉及基于邻近二态模型的Tm值计算技术。然而，尚有其他多种计算方法未被一一列举。

不同引物Tm值估计的差异有多大

以一段引物5' CATAG 3'为参照，我们对比了多种计算方法在估计引物Tm值时的差异。通过使用某软件进行预测，得到的Tm值为65.2摄氏度。然而，当采用在线网页提供的不同计算方法时，Tm值则变为68.99摄氏度。这两个结果之间的差异大约有4摄氏度。观察发现，相同的引物在多种软件的预测过程中，其Tm值存在差异；值得注意的是，在进行两个软件的Tm值计算时，我已经对Na离子浓度等各项参数进行了统一调整。

图2.预测的Tm值

图3.在线网页预测的引物Tm值

写在后面的

从上述记录中可以观察到，对于引物Tm值的预测，不同方法得出的结果存在差异。我无法断言哪种方法更优。这是因为，利用热力学方程来预测引物的Tm值，仅是为了在实验设计中确定一个适宜的退火温度区间。实际上，在实验操作中，推荐采用梯度优化来调整退火温度。此外，关于引物退火温度的预测研究，距今已有超过20年的历史。在当前的版本更新之后，我们是否能够运用新型的算法？比如，运用统计学习的方法，甚至是更为高级的机器学习模型，来构建一个更为精确的引物Tm值预测模型呢？

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