1.引言

此文本归纳了采集以及处理、面对定量1H、19F、31P且还有13C, NMR数据的程序。留意一下，定量NMR（现今一般称作qNMR）可不单单是收集一维光谱以及比较积分这回事。为能获取准确又精确的, 而且是定量的结果，诸多参数是必须要拿去优化的。定量NMR大体上存在两种类型：

相对浓度测定

说到相对浓度测定，您得把感兴趣的积分相互作比较，如此一来，就算测不出实际浓度本身，也能测量不同物种的准确比率。

绝对浓度测定

有关于绝对浓度测定，您得把目标积分同已知浓度标准品去做比较，并且从这些绝对值那儿得出浓度，得出产量，得出纯度。浓度标准品称作内标物或者校准品，用来跟参比化合物区分开，参比化合物能够用于化学位移参考。

2.相对浓度测定

相对浓度测定，是有机化学里极为常见的定量NMR实验类型，还是最易于设置的。此方法会给您提供混合物中化合物的比例。典型应用涵盖纯度评估以及异构体比率测定。在制备样品之际，要保证您的化合物能溶于所选溶剂，浓度足够高以便产生良好的S/N，并且样品体积契合NMR。无需校准液。

3.绝对浓度测定

进行绝对浓度测定时，除上述涉及样品制备的要点外，您所准备的样品需含有已知量的内标物。对所有化合物的称量要尽量精准。校准液没必要在结构上与目标分析物有所关联，但它必须含有目标原子核，且具备不与分析物共振重叠的特性。要是校准剂形成的NMR波谱相对较为简单，仅有单线态共振，那将是很有利的。内标物的其他要求是，它们要具备化学惰性、在所用溶剂中有高度溶解性、挥发性低且T1弛豫时间不过长 。

内标物的选择原则如下：

化学反应惰性

所选内标物不得与待测样品和所选的氘代溶剂发生反应。

溶解性

所挑选的内标物，应当在所挑选的代溶剂里溶解性良好，起码得确保所称量的内标物，在所用体积的氘代溶剂当中完全溶解，要是内标物没有完全溶解，那么就会致使目标化合物含量高于真实数值。

分离度

所挑选的内标物的特征峰，要跟待测样品的共振峰相互分离，要是分离度不足，极易致使积分不准确，进而对化合物含量的结果准确性产生影响。当内标物选择在提高分离度方面存在困难之时，能够尝试去更换溶剂，或者改用频率更高的仪器，以此来改良分离度。

内标物的溯源性

通常情况下较为建议去使用具备有证性质的、拥有可溯源性这一特点的内标物，在获取那种有着有证特性且具备可湖源性的内标物遭遇困难之际，应当能够确保当下所使用的内标物是可以溯源至有着有证性质且具备可溯源性的标准物质的。中检院常用来自定量核磁方面的内标物：

要是校准液是以纯的形态存在，并且易于进行称量，这样也是有好处的。有几种常见的1H定量NMR内标物被提出来了，表1当中给出了一些更为流行的例子：

表1 常见内标物性质及溶解性

4.定量需要考虑的信号

进行定量核磁共振时，当分析有着多个峰的波谱之际，应当明确去分配用于定量的信号。而且，信号应尽可能地简单，也就是说单重态要好于多重态，并且和其他峰的重叠要尽可能地少。活泼氢质子，比如酰胺或羟基，是不应用于定量的，因为它们的范围很广且对样品条件敏感。要是信号重叠成为一个问题，那么可以通过改变溶剂或者pH值，亦或是使用辅助Shift试剂来解决这个问题。

5.采集

5-1 参数设置

光谱仪上提供用于定量实验的特定参数设置。

一般情况下，1H与19F实验不会采用13C去耦。这表明，在针对峰实施积分操作时（如下文所述），于为每个所考量的峰涵盖或者剔除单键卫星峰这件事上，要维持一致。可选择运用13C解耦能够消除卫星峰，并且避免它们和其他峰相互重叠，进而干扰到准确的定量。13C以及31P实验一定要运用反向门控去耦，以此防止通过NOE使信号增强。

5-2 匀场

把样品插到磁力架之后，起码得等待5分钟，使得样品温度达成平衡。对样品完成调谐与填充操作，接着运行初始1D光谱。精确的匀场对于定量NMR来讲异常关键，所以要是波谱呈现出匀场欠佳的迹象（也就是分辨率欠佳、峰宽或不对称），那就再次开展匀场。建议把旋转关掉，以此避免出现被称作“旋转边带”的伪影。要是多次尝试之后依旧观察到匀场不佳，那就从磁力架上把样品取出来，并且查看样品量是不是能够接受，样品是不是正确混合，以及核磁管是不是干净。

5-3 弛豫延迟

至关重要的是要确保，所有信号在脉冲之间完全弛豫。要使用弛豫延迟时间（“d1”），该时间至少是频谱中目标最慢弛豫信号的T1的五倍。这里存在一个主要问题，那就是样品中核的弛豫时间通常是未知的，不过它们能够通过反转恢复实验快速估计。中等分子中1H原子核的T1值，通常在0.5到4秒之间，而季碳中13C的T1值，通常在0.1到数十秒之间。对于非常长的13C弛豫时间，可能需要添加松弛剂。

假如，针对进行定量质子实验而言，要是样品里头最长的1H T1达4秒，那么循环时间就得设置成起码20秒。可是，于实践当中，循环时间乃是弛豫时间与采集时间加起来的总和。所以，要是采集时间是5秒，那么能够把弛豫延迟设定为15秒，总计20秒。要是弛豫时间不清楚，建议采用以下的d1值：1H为30s、19F为30s、31P为30s、13C为60s 。

5-4 激发角度

90°角激发将会被采用，与常规氢谱采集时普遍采用30°角激发相比较而言，90°角激发能够获取到两倍的信噪比（要是想获得同样的信噪比，要是采用30°角激发这种情况得话，扫描的次数需要相应提升为4倍）。完全实现弛豫通常而言要求D1等待的时间为特征峰以及内标物峰质子中较长弛豫时间的7倍，然而对于30°角激发来讲，D1等待时间只可以缩短变成为6倍特征峰与内标物峰质子中较长弛豫时间。所以，90°角激发属于更好的选择。

5-5 频谱窗口

频谱两边得有充足的“空白”空间，以此来保证所需信号不会受到接收机滤波器引发的衰减的干扰。较大的光谱宽度对基线校正也有帮助。依据经验，要设置光谱宽度，让光谱的末端在每一侧都延伸大概10%的“空白”空间。

5-6 数字分辨率

每个峰要被准确积分，应至少由四个能覆盖线宽的数据点来描述，更多则更好。数字分辨率是由光谱宽度 by采集点数所得结果的一半来定义，这也等同于采集时间的倒数。中小分子的典型线宽是1 Hz，所以最小数字分辨率应为0.2 Hz，这对应着5秒的采集时间。频谱里的数字分辨率可通过命令来确定。在之前定义了恰当的光谱宽度以后，要使用参数“td”，把数字分辨率设置成至少为sw除以（td除以2）Hz 。

5-7 信噪比

良好的信噪比对于精确集成至关重要。对于

5-8 激发带宽

1. 共振的均匀激发，同样是qNMR的基础要求，对1H光谱而言，运用标准参数，不难达成这一点，然而，针对呈现出更大化学位移分散的原子核，却是需要小心留意的。 2. 鉴于19F NMR的频率偏高，且化学位移范围比较大，这对13F NMR来讲，属于一个特别的问题，不过，对13C NMR而言，也有可能是个问题。 3. 在这种状况之下，建议对比具备相似化学位移的共振，并且挑选能够达成该目的的校准剂mestrenova mac，同时，把频谱中心，也就是定义发射机激发频率“O1P”的位置，放置在要对比的峰的中点处。采用频率扫描绝热脉冲激发的替代序列可能会提供更好的结果。

6.数据处理

6-1 零填充

需要确保进行零填充mestrenova mac，由于这样会提升积分精度。要进行零填充，就得把实际频谱的大小（“SI”）设定为所用数据点数（“TD”）的倍数。将SI设置成等于TD是零填充的最小量，一般情况下这种程度就足够了。

6-2 谱线展宽

建议采用谱线展宽，尤其在频谱具备低S/N情形下。一般会运用指数加权函数。此由参数“LB”予以控制，在默认状况下，1H以及1F被设置成19 Hz，13C被设置成1 Hz。加大线展宽会使S/N得以增加，然而会致使分辨率降低。相反地，缩减谱线展宽会以牺牲S/N作为代价来提升分辨率。处于0.2至1 Hz 之间的数值是1H和19F光谱的典型数值。13C光谱会使用更高的数值，通常是在1 - 5 Hz范围之内。所以呢，如果存在需要提升分辨率这样的情况，又或者是要提高S/N，那么能够借助更改谱线展宽这种方式来达成，。

6-3 相位调整

可以自动定相光谱，比如说，会用到“apk”命令。然而，得对相位加以检查，目的是保证它处于最佳状态，参考图1就能明白。不然的话，就要手动去做相位调整。

6-4 基线校正

平坦的基线，其对于准确积分而言是很重要的。谱图完成之后，基线会借助布鲁克“abs n”命令来自动校正。然而，应当手动去检查基线，并且在必要的情况时进行更正，可参考图1 。

（图1）

6-5 定义适当的积分区域

若要覆盖百分之九十九的峰面积，积分区域于每个方向之上应覆盖最少二十倍线宽（见图二）。要是信号重叠属于一个问题，能够降低积分限值，然而对所有峰采用相同的积分限值颇为重要。举例来讲，倘若每侧的峰积分测量为正负五十赫兹，那么所有其他峰同样必须测量得正负五十赫兹。另外，要是碳十三卫星或旋转边带被涵盖于一个峰的积分区之中，那么所有其他测量的峰均应该包括碳十三卫星或旋转边带。要是信号重叠的程度非常厉害，以至于不被允许存在恰当的积分区域，那么就能够采用峰值去卷积，比如处于某种情况之中。

（图2）

溶解性

所选内标物应在所选的代溶剂溶解性好，至少要保证所称量的内标物在所用体积内的氘代溶剂中完全溶解，如果内标物没有完全溶解，则会造成目标化合物含量高于真实值。

7.分析

7-1 定量核磁共振相对浓度测定

基本上，您会需要去整合那感兴趣的信号，要对质子数量实施归一化，还要进行简单的比率分析。两种化合物x和y之间有个摩尔比Mx/My，它能够借助下面这个公式来确定：

其中I是积分，N是产生信号的原子核数。

7-2 绝对浓度测定

该分析可以得出分析物的浓度，也可以直接提供其纯度的量度。

7-2-1 摩尔浓度

与对应的内标物信号，按所产生信号的质子数，要进行积分以及归一化。而后，得把目标化合物的积分拿来和内标物的积分做比较。在校准品有存在状况下，化合物x的浓度能够用以下公式去计算：

目标化合物（x）的积分面积、原子核数、浓度分别为I、N、C，内标物（cal）的积分面积、原子核数、浓度同样为积积分面积、原子核数浓度，这里假设内标物纯度为100%，若不知内标物纯度，先进行纯度分析或许会有帮助。

7-2-2 纯度/产量测定

化合物x的纯度（占其标称重量的百分比）可使用以下公式确定：

当中，I、N、M、W以及P分别是目标化合物（x）以及呢内标物（cal）的积分面积（I）、原子核数（N）、分子量（M）、重量（W）还有纯度（P）。鉴于这是一个基于重量的纯度百分比，所以即便NMR看不到样品里的其他成分，它也能够让您去评估纯度。

比如说，图3展现了氨基酸丙氨酸商业样品的纯度测定情况，采用1.2mg DSS（纯度为98%）当作内部校准标准品，对1.78mg丙氨酸的标称质量数展开了测试。

如有侵权请联系删除！