引言

人类基因组恰似一座极其宏伟、藏书数量多达亿万的巨型图书馆, 每一本书籍都是一个基因, 其记载着生命活动的独特指令, 然而, 要使得图书馆能够顺利正常运转, 仅仅只有书是远远不够的, 还必须要拥有一整套复杂的索引以及管理系统, 在基因的这个繁杂世界里, 该系统的其中一部分被称作“增强子”。它们仿佛是散布在图书馆许许多多不同角落的那种 “阅读指南”, 尽管自身并不记录指令, 然而却能够精确地寻觅到特定的书籍（基因）, 并且指示 “图书管理员”（转录机器）去“研读”它, 进而开启基因的表达。

一个让人感到困惑不已的难题在于, 那些“阅读指南”也就是增强子, 常常和它们所要调控的书也就是基因, 在DNA这条呈线性排列的序列上, 相互间隔的距离极为遥远, 有时相隔幅度甚至达到了数百万个碱基。它们究竟是怎样跨越众多艰难险阻, 达成精准对接的? 答案隐匿在家基因组的三维也就是3D结构当中。原来, DNA长链在体积微小的细胞核内部, 并不是毫无规律地胡乱堆放, 而是借助精妙的折叠方式, 把距离遥远的区域在空间方面拉近, 从而形成了所谓的“染色质环”()。这恰似把图书馆中相距甚远的书架予以折叠, 致使一本关键书籍与其专属阅读指南紧密相挨。可是, 要明晰这种三维折叠的精巧模样, 特别是在单个细胞的规模上观测这般动态、高度异质性的进程, 始终实属一项巨大的技术挑战, 7月2日, 《》的研究报道“--ulti-”, 研究团队研发出一项名为“单细胞Micro-C”(-C)崭新鲜有的技术。它好似一台具备超高分辨率的3D“显微镜”, 以从未有过的精度, 揭示了单个细胞内基因组的折叠奥秘。凭借这件有效的工具, 他们不但看清了基因调控的精细结构, 还发现了一种名为“启动子 - 增强子条带”(-,PES)这样的特殊结构, 并且借此揭示了多个增强子协同发挥作用的“指挥中心”, 也就是说明多增强子中心(multi-)的普遍存在。

打造单细胞基因组“显微镜”

在对于微观世界展开探索的漫漫征程之中, 工具方面的革新基本上常常是拥有突破性发现的前提条件。于3D基因组学这个领域里面, 像Hi-C这样的主流技术, 依靠的是限制性内切酶去对DNA进行“剪切”。这种酶就好像是一把仅仅会剪特定图案的剪刀一样, 它仅仅能在DNA序列上特定的识别位点处下刀。此种方法的局限性是非常明显的: 要是两个需要开展研究的区域相互间恰好欠缺合适的剪切位点, 那么它们相互之间的空间互作信息便有可能被遗漏掉, 从而致使最终绘制出来的3D基因组图谱分辨率受到制约。

研究人员多年前开发了名为Micro-C的技术。其目的在于获得更精细的图谱。该技术用一种名为微球菌核酸酶, 也就是MNase的“剪刀”取代了限制性内切酶。MNase的巧妙之处在于, 它不识别特定序列。而是优先剪切核小体。核小体是那种包裹DNA的蛋白质复合体。连接这种复合体之间区域是核小体有连接区域。这使得DNA被切割得更加均匀和细致。理论上它拥有能够达到单个核小体的超高分辨率。然而, 把这种精巧的“批量处理”技术运用到脆弱且宝贵的单个细胞上时, 碰到了新的难题, 其中, DNA样本会因过度消化, 致使连接效率低下, 进而大量损失, 并且这使得最终能捕获到的有效信息少之又少。

对这一挑战予以面对, 研究人员针对原有的Micro-C流程, 开展了三项具有关键性的改良, 最终成功打造出了强大的-C技术。

第一项也是具备着最为关键性质的有关改良, 乃是引领进来了一种离子类型的去垢剂, 也就是十二烷基硫酸钠，简称为SDS。SDS可以产生有效作用来“溶解”染色质, 致使其结构朝着更为松散的状态转变。这一个步骤看起来好像比较简易, 然而所呈现出来的效果却是十分显著的。原本以紧密方式对其进行包裹的染色质被打开之后, 那些承担专门职责对DNA断端予以修复以及进行连接的酶能够以更为自由的状态去接触到DNA末端, 进而在极大程度上提高了后续阶段的连接效率。通过实验所获取的数据表明, 在经过SDS处理以后, 于单个细胞当中检测到的染色质接触之数量, 是未曾经过处理情况的8.1倍！这就好似把那原本模模糊糊、满是雪花点的电视信号, 刹那间切换到了高清频道, 信息量出现了爆炸性的增长。

第二项改良, 是对MNase的消化程度进行了系统性的优化。不过dnastar lasergene，若消化得太过, DNA碎片就会过短, 这对后续的建库与测序不利；要是消化得太轻, 又达不到高分辨率的要求。研究人员测试了一系列不同的MNase浓度, 如同在调试一台精密仪器的焦距。他们发觉, 在800U的浓度下, 既能有效切割染色质, 还保留了核小体定位和转录因子足迹等精细特质, 又能保证后续实验获取最高的接触信号比率以及最多的独特接触数量。这个处于恰好程度的消化状况, 给-C技术的高保真性形成了稳固根基, 为进而奠定坚实基础做出了贡献。

第三项改良所采用的是先进的全基因组扩增技术, 单个细胞的DNA含量极为微少, 所以必须经过扩增才可进行测序, 研究人员运用的是一种名为META的扩增方法, 并且省略了传统方法里繁琐的生物素富集步骤, 以此最大限度地保留每一个来之不易的染色质接触信号。

在借助一系列极为巧妙的优化之后, -C技术总算得以诞生, 当研究人员开展整合数百个单细胞数据这一行为（此状被称作-C）之际, 他们成功获取了一张具备7.5亿次接触情况的超高质量的基因组互作图谱, 这张图谱的分辨率高达令人极为惊叹的5kb, 这便意味着我们能够凭借前所未有的精准程度, 去仔细查看基因组里那些微小的结构单元, 像启动子、增强子及其二者之间的互动情形, 和经典的Hi-C技术进行比较的话, -C在检测染色质环以及条带等精细结构之时, 信噪比相对更高, 图像显得更为清晰。这台具备强大功能的单细胞“显微镜”, 为我们后续展开的探索, 在3D基因组的奥秘方面, 铺平了前行的道路。

从2D到3D：在单个细胞中“重建”染色体的真实样貌

获得了高精度的-C数据, 好似得到了一张记载着城市中任意两点间“通话频率”的详尽列表, 然而这仅仅是一张二维（2D）的接触图谱。对于研究人员而言, 终极目标是凭借这份列表重新构建出这座城市的三维（3D）立体模型并且直观展现出每条街道、每栋建筑的真实空间位置。

借助先前已开发的Dip - C算法, 研究人员顺利达成了将单个细胞（此为一种人类B淋巴细胞）的 - C接触图谱, 转变成为绝伦精美的3D基因组结构模型这一成果。在这些模型当中, 整条染色体被明晰地展现成一团由数目众多的小颗粒串联组合而成的繁杂结构。更让人感到振奋欣喜的是, 这些3D模型的解析度能够抵达20kb、10kb乃至5kb的程度。这所蕴含的意义是: 模型里的每一个小颗粒, 代表的单单只是基因组上一段长度为5kb的DNA片段。竟然有着这般高的解析度, 这使得我们最终获取了一次机遇，且还是在单个细胞的内部, 专为去查看那些以往仅仅能够于群体平均图谱里以模糊状态被看到的精细结构。

固然, 一个模型是不是可靠, 那是一定要经过严谨的检验的。研究人员运用计算模型里随便哪两个基因组位点之间的三维空间距离的方式, 并且把这个距离跟原始 - C 数据中的接触频率做比较, 结果发觉二者之间存在着极其强烈的负相关性。比如说, 在 20kb 分辨率的状况下, 相关系数（'sr）达到了高达 -0.931, 在 10kb 和 5kb 分辨率的时候也各自达到了 -0.922 和 -0.907。这样的结果证实了: 在 3D 模型里空间距离越靠近的两个位点, 在实验数据当中相互接触的频率确实是越高的。经此证实, -C实现了重建, 所构成的3D结构确实是具备真实可信度的那种, 此举给后续展开的分析送来了异常坚实的信心。

有了这数百个具备高分辨率、高保真度特点的单细胞3D基因组模型, 研究人员能够着手探索一些过去难以达到的科学问题, 像是多重互作的动态性。在一种经典的“嵌套环”结构里, 一个大环的内部含有几个小环, 就像俄罗斯套娃那样。以前人们不明白这些环是独自形成, 还是协同发挥作用。经由分析单个细胞的3D结构, 研究人员发觉, 这些嵌套的染色质环倾向于同时形成, 它们共存的频率远远高于随机概率。比如说, 在一块有着三个相互嵌套环的区域里头, 当科研人员察觉到环1生成之际, 环2以及环3同时生成的可能性显著提升。此项发现直接表明了染色质折叠进程里的协同性, 意味着背后兴许存在更为复杂的调控机制。这恰似观察一件精巧的折纸成品, 发觉几个貌似毫无关联的折痕老是一块儿出现, 这必定指向一个统一的折叠步骤。

用于基因调控的, 被称作“高速公路”的, 名为启动子 - 增强子条带的, 也就是PES的, 这一发现。

在高分辨率的接触图谱之上, 研究人员敏锐地留意到了一种反复出现的奇特样式, 于诸多活跃基因的区域之中, 从基因的转录起始位点（te, TSS）起始, 顺着基因转录的方向伸展, 延伸出一条清楚的、呈线状的强相互作用信号, 这条信号带看上去宛如一条从“起点站”（启动子）开始, 贯穿整个“线路”（基因体）的“高速公路”, 研究人员把这种结构命名为“启动子 - 增强子条带”（ - , PES）。

这个条带结构不是头一回被说起, 然而先前的研究常常把它归到更大范畴的“建筑学条带”里, 或者仅仅在少数几个基因那儿观察到过, 它的普遍性以及功能机制尚不清晰, 如今呢, 凭借高质量的Micro - C数据, 搞研究的人员才得以从头到尾地去识别和描述这类结构, 在细胞当中, 他们总共识别出819个带有清楚PES的基因。

PES的存在究竟有着怎样的意味呢? 研究人员率先解析了这一些“条带基因”的活性。结果呈现出令人惊叹的一致性: 和那些不存在条带的基因相比较, 携带PES的基因表达水平明显更高。统计检验表明, 两者表达量的差异极其显著（P值等于9.88乘10的负9次方）, 这有力地暗示了PES与高水平的基因激活紧密相关。

更进一步的剖析揭示出了PES的实质, 研究人员发觉, 在那些条带所覆盖的区域当中, 散布着数量众多的、被（一种代表活性增强的组蛋白修饰）标记的增强子, 当把所有PES基因的信号累计叠加起来开展分析的时候，能够清晰地看见, 从启动子出发的这条“高速公路”之上, 每当遇到“增强子出口”, 信号便会出现一个峰值, 这表明启动子与这些下游的增强子产生了频繁的接触。这意味着, PES结构或许是这样一种高效机制, 它能让一个基因的启动子, 与沿途众多的增强子, 展开持续且动态的沟通。

那么, 这条被称作“高速公路”的, 究竟是怎样建成的呢? 研究人员把目光转向了那负责塑造染色质环的“建筑师”, 也就是黏连蛋白()复合体。他们借助分析已有的蛋白质结合数据, 发现了这样的情况, 在PES基因的启动子区域, 黏连蛋白的结合信号, 明显强于非PES基因。这就暗示出, 黏连蛋白深度参与到了PES的形成过程中。

研究人员为了验证这一猜想, 对小鼠胚胎干细胞中敲除黏连蛋白相关基因的Micro - C数据进行了分析。结果那里提供了决定性的证据, 证据表明当黏连蛋白的核心亚基RAD21被降解后, 原本清晰的PES几乎完全消失了。与之情形相反, 当负责将黏连蛋白从DNA上卸载下来的WAPL蛋白被降解后, PES也相应地变得更长、更强。

以这些证据为依据, 一个明晰的模型显现出来: 黏连蛋白复合体好似一个马达, 固定在基因的启动子处, 接着开启“环挤压”进程, 也就是把下游的 DNA 像绳索那般持续地“拽”过来, 形成一个逐步变大的染色质环。在这个进程里, 启动子宛如一个“扫描头”, 随着 DNA 被拉近而逐一扫过下游的每个增强子, 进而有机会与它们产生相互作用。这条经由环挤压形成的动态扫描轨迹, 在群体细胞的接触图谱上, 呈现为我们所看到的 PES。

众星捧月——解密多增强子中心(Multi-)的协作密码

PES的发现, 勾勒出一幅启动子同多个增强子频繁“接触”的宏观画面。然而, 这幅“合照”依旧没法解答一个更深入的问题: 在任一具体时刻、任一细胞内部, 启动子是仅与一个增强子相互作用, 还是能够同时和多个增强子构成一个“合作团队”? 倘若这个“合作团队”存在, 它究竟是怎样的形态?

研究人员为了回答这个问题, 把他们的-C“显微镜”聚焦到了一个典型的PES基因, 也就是EBF1。这个基因在B细胞发育里起着至关重要的作用, 它的接触图谱上展现出一条长达404kb的完美PES, 在这沿途分布着7个已知的活性增强子。

研究人员借助分析几百个单个细胞的3D结构dnastar lasergene，从而能够窥视到EBF1基因座上增强子－启动子相互作用的实际动态情况, 他们发觉, 在大概30%的细胞当中, 启动子跟下游的某一个增强子构成了紧密的染色质环, 然而在其他细胞里, 这种环结构并未形成, 这形象地展现出基因调控在细胞之间的极大异质性以及动态性。

跟随着的是, 那最为激动人心的发现一个接着一个到来。研究人员着手在每一个单细胞的3D模型里, 去计算究竟有多少个增强子, 是同时和EBF1的启动子处于紧密接触的状态。最后的结果表明, 尽管其中大部分的接触都是一对一的, 然而在数量颇为可观的细胞当中，出现了两个、三个, 甚至是更多个增强子, 一同与启动子聚集在一块儿的情形。比如说, 他们观察到, 有66个细胞形成了双增强子 - 启动子复合体, 51个细胞形成了三增强子复合体, 甚至在8个细胞里, 还有数量多达六个的增强子, 紧紧地簇拥在启动子周围。

从事研究工作的人员, 给这种由多个增强子跟一个启动子, 在空间层面所形成的, 具备瞬时性以及, 呈现高密度状态的聚合体这种情况的样子, 予以特定的定义名称为“多增强子中心”(multi-)。借助3D可视化的技术手段帮助后能够知晓“中心”这种情况的结构, 清晰得能够一眼看清: 原本处于散落分布状态, 在以线性形式存在的DNA各处位置的增强这个机能本身的子部分, 呈现出一种好像众行星围绕着月亮运转相似样子的情态, 从各方不同的方向朝着启动这个动作相关部分紧密聚集于相近周围, 从而形成一个呈现紧凑情况的进行调控的核心中枢部分。

这种呈现出宛若“抱团取暖”样式一般的结构, 究竟只是属于那样一种偶然性质的聚集, 还是具备着带有功能性的协同效应? 针对此情况, 研究人员更进一步地去分析了多增强子处在中心位置时所具备的物理特性。他们专门进而计算得出归属于包含有着不同数量增强子的EBF1基因区域的“回转半径”（）, 而这个所谓的“回转半径”（）乃是用来衡量结构紧凑程度的一个物理量。最终所呈现出来的结果非常清晰地显示出这样一种状况: 伴随着处在中心位置区域之内从事参与的增强子数量不断增加, 整个那一大块基因区域的回转半径持续不间断地减小。那也就意味着, 有越多的增强子参与进入到中心位置区域里, 整个结构就从事进行的折叠就会越发紧凑。有这样一种协同性的压缩效应, 它强烈地暗示了, 增强子之间存在着相互吸引和合作, 同时增强子与启动子之间也存在着相互吸引和合作, 它们共同稳定了这个高效的转录调控“指挥中心”。

虚拟与现实的碰撞：计算机模拟揭示“中心”形成的物理法则

已有实验证实了PES的存在、多增强子中心的存在, 还指出了黏连蛋白身处其中所发挥的关键作用。 然而这些复杂三维结构形成, 那其背后的物理驱动力到底是什么东西? 是仅仅依靠黏连蛋白的环挤压, 机械地把各个元件拉扯到一块儿吗? 又或者说增强子与启动子上那些结合着的转录因子之间会不会存在某种化学吸引力, 才促使它们径自聚集起来?

对于在真实细胞里精准地去解耦那两种力量, 并且分别对它们的作用展开研究, 着实是极为困难的。于是呢 , 研究人员通过巧妙地运用另外一种强大的研究工具 , 也就是高分子聚合物模拟()。他们构建了一个EBF1基因的“虚拟模型” , 在这个特定的模型当中 , DNA被简化成了一串彼此相互连接的珠子 , 而黏连蛋白的环挤压 , 还有增强子和启动子之间的分子亲和力等等情况 , 全部都能够作为可以被精确控制的可调参数。

研究人员借助运行一系列计算机模拟, 在虚拟世界里重构了PES和多增强子中心的形成过程, 当他们把黏连蛋白的环挤压以及增强子/启动子之间的分子吸引力, 在同一时间引入模型后, 奇迹竟然出现了！模拟出来的接触图谱, 不但完美地重现了实验中观察到的PES条带, 还一并重现了启动子-增强子之间强烈的环信号, 以及在单个聚合物链中频繁出现的多增强子中心结构。虚拟模型的输出结果, 与真实的-C实验数据达成了惊人的一致。

这一组模拟得出的结果, 给咱们展现出了多增强子中心形成的关键准则, 此乃一个分两步进行的协同流程。其一, 由黏连蛋白带动的环挤压行为, 好似一只勤快的手, 把启动子以及下游的多个增强子机械性地、非特异性地拉近, 为它们的碰面造就了物理层面的可能性。其二, 在这些被拉近的元件相互之间, 由转录因子等介导产生的分子亲和力开始发挥效能, 它们仿若微小的磁铁那般, 把正确的增强子与启动子“吸”至一处, 稳固成一个紧凑且高效的多增强子中心。

丈量基因组的艺术：从线性序列到生命的三维蓝图

由开发一台前所未有的单细胞3D基因组“显微镜”开始, 接着发现连接启动子与增强子的“高速公路”(PES), 而后揭示多个增强子协同作战的“指挥中心”(multi-),这项研究指导我们完成一趟对基因调控世界的深度探寻。它明白无误地告知, 生命之指令并非单单书写于一维的DNA序列之上, 而是借由精妙的三维折叠技艺, 于空间内里被组织以及执行。

- C技术出现了, 这使得我们头一回能够凭借接近“分子级”的清晰度, 去探究单个细胞内基因组的动态以及个性, 这是以前所没有办到过的呀。在这样的观察下, 我们发现, 基因调控可不是那种简简单单的“开 - 关”流程, 与之相不同, 它是一种充斥动态、有着协作关系且具备高度组织化特点的三维舞蹈狀态。PES结构以及多增强子中心被发现了, 这为我们弄清楚基因究竟怎样整合来自多个处于远距离位置调控单元的信号, 如此一来才能够达成精确、稳健的表达, 给出了一个全新的、让人信服的机制模型, 这个模型是之前并未有过的。

毋容置疑, 我们正身处于一个时代, 这个时代能够以空前绝后的深度以及广度去“丈量”基因组。每一回分辨率得以提升, 都极有可能带来对于生命基本法则颠覆性的认知。自从一维线性的碱基序列起就开始了, 一直到生命活动切实在上演的三维蓝图, -C为我们开启了一扇通向全新知识维度的门道。在这扇门道之后, 众多关于生命折叠深藏的秘奥秘奥, 正静等着我们前来发现并且解读的。

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