PART.1背景

即通过联发科定量测序技术的转录组测序分析技术，作为研究RNA表达水平和不同基因表达情况的应用，在过去的十年里得到了迅速的发展。 如今，它在转录本变异检测、基因融合测量、选择性剪接测量等场景中得到了大规模应用。 转录本变异检查是指将样本RNA序列与参考基因组的相应序列进行比较，以发现单核苷酸多态性和小片段的插入缺口。 结果主要用于确定治疗部位或识别性状。 研究。 融合基因是指两个或多个基因首尾相连，置于同一组调控序列的控制下，形成嵌合基因。 表达产物是融合蛋白。 在个体疾病中，融合基因的测量已成为重要的检测指标。

在数据分析方面，经过多年的探索和沉淀，行业针对不同的应用逐渐形成了相应的主流分析解决方案。 其中STAR作为经典的比对软件，已广泛应用于科学研究和临床RNA测序数据分析。 与同样经典的AND相比，STAR具有更高的uniq比，并且对较低（包括更软和错配的核苷酸）比较具有更高的容忍度，使其适合更复杂的分析需求。 因此，STAR 已成为 分析工作流程最佳实践的黄金标准。 此外，还结合使用突变检查、定量分析、融合测量等其他分析模块。

然而，这种开源软件的一个主要问题是速度慢、耗时长。 为了克服这一缺点，三鑫软件公司开发了相应的加速模块，包括用于比对步骤的STAR、重复数据删除模块、RNA处理模块和突变检查模块，以缩短分析过程的持续时间。

但从加速分析模块到针对特定临床研究环境的分析流程还有很长的路要走。 因此，我们与富君基因和纳岩科技合作，共同构建了一个分析流程，使用标准产品或真实临床样本产生的数据。 对STAR在RNA变异检测、基因表达定量和融合基因检测方面的性能进行评估，并与开源流程进行比较，为业界选择分析流程提供更真实的数据参考。

PART.2RNA突变检查

RNA变异（SNP和Indel）测量的重要性逐渐被您认识到。 与DNA突变相比，RNA突变对于异常蛋白质的产生具有更直接的意义，因此它们的临床应用开始被大家所接受。 相比之下，加速分析的重要性也显现出来，因为它直接关系到受试者能否及时获得准确的检测结果。

与DNA变异检查类似，RNA变异检查流程也遵循业界金标准GATK流程，包括STAR比对、去重、处理、Indel重复比对（可选）、BQSR、最终突变检查等多个步骤。 在本次流程搭建中，我们使用了新开发的STAR加速模块，配合其他可用的加速模块，完成了整个RNA变异检测流程的搭建。

我们选择了2个样本进行性能测试，运行了包括原始STAR（版本2.7.8a）和GATK（版本4.2.0）在内的最佳实践流程，并给予相同数量的线程再次运行构建的流程。 然后进行速率和一致性比较。 从速度上来说，各个模块的速度是比较显着的。 两个样品整个过程的速度分别是6.6倍和23.9倍。 两种工艺的一致性在98.6-98.8%左右。 主要差异来自 GATK 版本号的不匹配。

PART.3RNA定量与基因融合

对于基因定量，合作伙伴使用 SIRV 样本作为测试样本。 SIRV基因是该公司人工合成的7个基因。 每个基因有多个转录本，共有69个转录本。 它可用于测量交变剪切波并用作定量内参。 在这份转录数据中，选择了20个不同起始摩尔量的样品，分别与原始STAR和STAR进行比较，然后用于定量。 实验中总共对转录本进行了定量dnastar序列比对，与STAR过程的定量结果完全一致。 由于这类样本的数据量较小，STAR在定量过程中所占比例并不大，因此加速效果不是很显着。

此外，合作伙伴还构建并测量了基因融合过程。 所用参考标准品（）含有16个已确认的基因融合风暴，按照不同比例与阳性样本混合，生成5个样本（目标产量）。 0.23%-50%)作为评价样品。 流程上dnastar序列比对，测试用STAR代替原来的STAR进行测试，并与原来的版本进行比较。 从结果来看，由于测试的STAR-中的STAR版本（2.7.2b）与STAR的匹配版本（2.7.8a）不同，因此两个过程的检出率和特异性也略有不同。 总的来说，该工艺在PPV上性能较好，但在PPV上稍低。

第四部分总结

在本次三方合作中，团队提供模块组件，富君团队搭建并测试了RNA变异检测流程，纳花清团队负责RNA定量和基因融合的相关部分。 通过真实的数据评估，我们用数据展示了该工艺在三种不同应用中的性能提升，希望为业界选择合适的分析工艺提供参考。

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