PCR是法国科学家Mulis在体外简化条件下模拟体内DNA复制而提出的一种快速、大规模的DNA扩增方法。 这项技术获得了1993年的诺贝尔物理学奖。 以待扩增的DNA分子为模板，与模板互补的一对寡核苷酸片段为质粒，在DNA聚合酶的作用下，按半保守复制的机制沿模板链延伸，直至合成新的DNA完成了 。

——Kary B.

1个

聚合酶链反应简介

PCR反应条件

1. PCR反应组分

(1)模板

A。 单链和双链DNA均可使用

b. 纯化的蛋白质、多糖、酚类等抑制PCR反应

C。 浓度通常为100ng/100µL，太低会导致非特异性扩增减少

d. 完整模板的降解会导致PCR扩增无产物

(2) 质粒

A。 设计适当的宽度以避免二级结构和二聚体

b. 完整性防止反复冷冻和解冻

C。 浓度为0.1-1.0μmol/L。 含量过低，易造成模板与质粒错配，反应特异性增加； 如果含量太低，扩增产物就会太少。

(3) ddH2O

补充体系，pH值适宜，防止污染

(4) 反应

a、pH、盐离子、稳定剂、增强剂 b、提供缓冲环境

(5) 镁2+

A。 浓度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶激活剂。 含量过高会导致Taq酶活性丧失，PCR产值升高； 如果含量太低，则不具体且严重。

b. 能与负离子结合，因此反应体系中dNTP、EDTA等的含量影响反应中游离Mg2+的含量。

(6) dNTPs

A。 浓度通常为20-200μmol/L，四者应相等。 含量取决于扩增产物的宽度。 如果含量太低，容易造成错误的核苷酸掺入。 含量过高会降低反应产值，可与Mg2+合用。 增加游离Mg2+含量，影响DNA聚合酶活性。

b. 避免反复冻融 (7) 聚合酶

C。 浓度为0.5-2.5U/50µl，酶量的减少会增加反应的特异性； 酶量过少会影响反应产值。

2. PCR反应循环参数

(1)变性——双链DNA熔解成单链——93-95℃，20-30秒——变性温度低，熔解不完全是PCR实验失败的主要原因

(2)固溶-湿度40-60°C，由质粒宽度和GC浓度决定，通常Ta=Tm-3~5°C-降低体温可减少非特异性结合质粒到模板； 升高体温可降低反应的敏感性。 - 时间 30-60 秒

(3)延伸——温度70-75℃，一般72℃，湿度太低不利于质粒与模板结合——时间根据扩增片段的粗细而定，1kb以内， 1min就够了，延伸时间太长会造成非特异性，但对于低含量模板的扩增需要延长时间。

(4)循环次数——主要取决于模板DNA的含量，一般为25-35次——过多：扩增效率提高，错误掺入率降低

PCR质粒设计

A。 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

b. 引物设计的最大原则是最大化扩增效率和特异性； 同时最大限度地减少非特异性扩增。

一、设计原则

首先，该序列应位于高度保守的区域，与非扩增区域没有同源序列。

(1)宽度质粒的厚度通常为15-30bp，一般为18-24bp，但扩增长片段时，质粒的宽度为30-35bp。 过短的质粒容易造成错配。 例子：一个12bp的质粒在人类基因组上有200个潜在的固溶位点，而一个20bp的质粒在人类基因组上只有1/400个固溶位点。 较长的质粒（28-35bp）常用于区分同源性较高的模板序列或形成一些突变位点。

(2) GC浓度质粒序列的GC浓度通常为40-60%dnastar引物设计，过低或过高都不利于引起反应。 上游和下游质粒的 GC 浓度不应相差太大。

(3) 结构尽量避免质粒序列产生，尤其是3'端。 尽量避免质粒之间的二聚体，尤其是 3' 端的前 3 个核苷酸之间。 避免部分含有GC或AT，避免3'端连续相同的核苷酸，如GGG、CCC、。

(4) 错配 尽量避免质粒模板上的错配位点。 当不防止错配时，优选不形成产物。 特别是 3' 端不应产生非特异性结合。 质粒3'端连续3个以上的核苷酸，如GGG或CCC，也会降低出错的概率。

2.设计软件

PCR质粒设计主要通过计算机软件进行。 您可以直接将模板序列提交至特定网页获取设计好的质粒，也可以在本地电脑上运行专业的质粒设计软件。 质粒设计需要一定的经验，不能单靠软件。

常用软件

.0（手动搜索）*

（质粒评价）

西装

奥米加

（在线服务）

.0 使用介绍

1..0 下载并安装。 -sbio.tmmu.com.cn首页下载中心

2..0演示

.0 使用步骤：

(1) 粘贴序列：复制序列>文件>新建>DNA>Ctrl+V，选择ASis

2.>搜索>设置质粒参数>确定

3. 搜索完成后，点击确定，选择符合要求的质粒序列。

4. Blast 检测质粒特异性，必要时重新设计。

.0 评估质粒方式

粘贴序列：复制序列>文件>新建>DNA>Ctrl+V，选择ASis

2.>S>编辑>Ctrl+V>>>确定

3.>A>编辑>Ctrl+V>>>确定

关于 PCR 的常见问题

1.无扩增产物

现象：阳性对照有条带，样品无条带

原因：1、模板：含有丰富的抑制剂，浓度低

2. 质粒：错误、设计不当、降解、合成和纯化不良

3、反应条件：固溶温度不合适，延伸时间太短，循环次数少

对策：1、纯化模板或使用优质试剂盒提取模板DNA，或强化模板

数量

2. 合成前检测，重新设计，更换管子，重新合成

3.梯度PCR，延长延伸时间，增加循环次数

2. 非特异性扩增

现象：条带与预期大小不符或非特异性扩增条带

原因：1、质粒特异性差

2.模板或质粒含量过低

3、酵素过多

4、Mg2+含量过高

5、固溶体温度过高

6. 循环太多

对策：1.重新设计质粒或使用巢式PCR

2.适当增加模板或质粒含量

3、适当减少酶的用量

4.增加镁离子含量

5、适当增加固溶湿度或采用两段升温法

6.减少循环次数

3.尾随

现象：产品在凝胶上呈涂抹状

原因：1.模板不纯

2.不适合

3、固溶体温度过高

4、酵素过多

5、dNTP和Mg2+含量过高

6.循环次数过高

对策：1.净化模板

2.更换

3、适当减少酶的用量

4.增加dNTP和镁离子含量

5、适当提高固溶温度

6.减少循环次数

4.污染

现象：目的扩增产物出现在空白对照中

原因：目标序列或扩增产物的交叉污染

对策： 操作温和，避免气溶胶污染； 避免将目标序列吸入采样枪

或飞溅出离心管

b. 试剂应先包装，再高温保存

C。 低温高压灭菌试剂或耗材

d. 更换实验室或试剂耗材

增强 PCR 特异性的方法

A。 巢式PCR

增加扩增多个目标位点的可能性，由于目标序列与多组质粒配对

很少。 对有限量的目标序列（如稀有 mRNA）的敏感性降低。提高困倦

困难的 PCR（例如 5'RACE）特异性

b、降序聚合酶链式反应（PCR）

PCR的前几个循环使用严格的固溶条件以提高特异性。loop set

从比计算的 Tm 高约 5°C 的溶液温度开始，然后每个循环

增加1-2°C直到固溶温度比Tm高5°C。 特异性最高的目标

模板将被优先扩增，该产物将在后续循环中继续扩增。

根据 . PCR 对那些不知道质粒和目标模板之间同源性程度的人很有用。

度数高的方法比较有用，比如AFLPdnastar引物设计，DNA指纹等。

C。 热启动 PCR（PCR

热启动主要通过抑制一种碱性成分来延缓DNA合成，直到

PCR仪达到变性温度； 一般选用热启动Taq酶； 热启动 PCR 是

除了良好的质粒设计，提高PCR特异性的最重要途径之一

d. PCR增强子

甲基丙基酯、DMSO、甘油、马铃薯碱等均可作为PCR增强剂。

可能的机制：加强GC高链的熔解，提高熔解温度，有利于引物

固溶体，有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区域。增强子的含量应适当

什么时候。

2个

逆转录聚合酶链反应 (-PCR)

• 一种将RNA 逆转录(RT) 与cDNA 聚合酶链扩增(PCR) 相结合的技术。 首先，在逆转录酶的帮助下，由RNA合成cDNA，然后以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

• RT-PCR是目前从组织或细胞中获取目的基因，对序列已知的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法。

转播

1. 转发

•反转录()

以RNA为模板合成与RNA互补的DNA的过程。

• 逆转录酶（RNA 依赖性 DNA 聚合酶）

RNA 指导的 DNA 聚合酶活性

2. RNA酯酶活性

3. DNA 定向 DNA 聚合酶活性

2. RT 反应组分

(1)模板组织或培养细胞RNA

(2) 质粒、随机质粒、基因特异性质粒

(3)逆转录酶AMV、M-MLV、Super-、Quant

(4) 核糖核酸酶抑制剂

(5) 四种底物含量相等的dNTPs

(6) 反应环境缓冲液（RT）

3. RT 质粒的选择

A。 随机质粒：适用于特异性最低的长RNA或发夹RNA。

在 20µl 系统中起始含量范围为 50-250µg。

b. Oligo(dT15-18)：适用于带PolyA尾的RNA，目标片段距离

polyA 在 2 kb 以内。 在 20µl 系统中起始浓度范围为 0.2-0.5µg。

C。 特异性质粒：与靶序列互补，是反义寡核苷酸，适合靶序列

对于已知情况，起始含量范围为 20µl 系统中的 1pmol。

d. RT逆转录酶的选择

• AMV：禽成髓细胞增多症病毒、逆转录酶和RNase H 活性。

最佳温度为42-60°C。

• MMLV：鼠癌病毒、逆转录酶、RNase

H活性弱。 最佳温度为 37°C 或 42°C。

• 超：MMLV 反转

转化大部分 RNA 的转录酶的 突变体

转化为cDNA，最适温度为42℃。

•Quant：一种新型高效逆转录酶，

与RNA模板亲和力强，研究对高GC浓度模板的疗效

好，品质稳定，最佳温度37℃。

RT-PCR方法

两步法 RT 和 PCR 分别进行

同时一步 RT 和 PCR

• 两步和一步 RT-PCR 的比较

两步法 一步法

质粒，随机质粒，

优点 • 易于分析PCR扩增失败的原因。 • 高特异性和敏感性；

•分别在最佳条件下进行，反应效率高•操作简单，污染概率低

• cDNA可全年保存

适用 • 用于mRNA表达分析 • 适用于病毒和病原体检测

•多个目标基因的监测 •大量样本的分析

•半定量RT-PCR•定性

RT-PCR元件

分离优质RNA-含量OD260/280=1.8-2.0；-完整性1.2甲醛变性凝胶显示28S和18S条带明亮清晰，28S色温是18S的两倍以上；-防止RNase污染分离时 使用高活性逆转录酶 提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染

RT-PCR 常见问题

1.无扩增产物

现象：阳性对照有条带，样品无条带

原因： A. RNA 降解或初始量低

b. RNA含有抑制成分

C。 cDNA 5'端不完整

d. 目的基因未表达或在组织中表达量过低

对策： 分离高质量的RNA

b. 使用低温逆转录酶

C。 使用随机质粒或 GSP

d. 尝试其他组织

2. 非特异性扩增

现象：条带与预期大小不符或非特异性扩增

原因： A. 弱基因特异性质粒

b. 模板与质粒之间的非特异性固溶体

C。 Mg2+含量过高

d. RNA 中的内源性或外源性 DNA 污染

e. 质粒二聚体的产生

对策： 重新设计质粒

b. 使用基因特异性质粒或 PCR 进行逆转录

C。 增加镁离子含量

d. 使用带过滤吸头的放大级处理过的 RNA，或质粒组

计数跨越内含子。

e. 设计 3' 端无互补序列的引物

3.尾随

现象：产品在凝胶上呈涂抹状

原因： A. cDNA含量太低

b. DNA 降解时形成的寡核苷酸的非特异性扩增

C。 PCR 反应中的质粒过多

d. 循环次数太少

e. 固溶温度过高

对策： 减少 cDNA 的用量或降低稀释倍数

b. 提取优质RNA，质粒设计跨越内含子，避免基因组污染

质粒使用效率降低

C。 优化PCR反应体系

d. 适当提高固溶温度

RT-PCR应用

1. 获取目的基因

2. RNA定性和半定量分析

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实时荧光定量PCR（）

常规PCR是对PCR扩增反应的末端产物进行定量和定性分析。 起始模板的精确量化是不可能的，扩增反应的实时监测也是不可能的。 Real-time PCR在PCR反应体系中加入荧光功能基团，利用荧光信号积累技术实时检测目的基因扩增，通过Ct值和标准曲线的处理对初始模板进行定性和定量分析.

方式介绍

非特异性荧光标记： 1. ：

特异性荧光标记： 2.:

3.:

方法 1 - 方法

工作机制

•可以结合双链DNA的小沟

• 只有在与双链 DNA 结合时才会发出荧光

•变性时，DNA双链分离，无荧光

• 在重折叠和延伸过程中，会产生双链 DNA，此时 会发出荧光

荧光信号

优势

 DNA模板无选择性——适用于任何DNA

易于使用 - 无需设计复杂的探头 

非常敏感

负担得起的

缺点

 容易与非特异性双链（如质粒聚集体）DNA结合，造成假阴性，但

可以通过优化反应条件来改变，需要熔体曲线

 不支持多荧光设计

方法二----

工作机制

标记荧光头套探头

茎由与目标序列互补的5-7个碱基环和15-30个核心组成的互补配对序列组成

核酸，分子信标会支化，荧光侧链断裂后形成的光子被官能团猝灭

随着猝灭，荧光复合物形成的能量以红外线而不是可见光的形式释放。

优势

 特异性高，是检测目标序列中SNP最灵敏的试剂之一

 灵敏度高，低至1个核苷酸拷贝均可测量

缺点

 只能用于一个特定目的

 设计难度大

 价格相对较高

方法 3 - 方法

工作机制

A。 酯化杂交探针与靶序列互补。 5'端标有报告功能团

(,R)，例如 FAM™、VIC®、JOE™、NED™、CY3™、CY5™，

德州红®等

b. 3'端标记有荧光猝灭复合物（,Q），如TAMRA™、MGB

(non-)等 探针完整，R发出的荧光能量被Q官能团吸收

收到，无荧光； R 和 Q 分离，发荧光 • 对于每个扩增的 DNA 分子，一个

可在循环过程中测量的荧光信号 • Taq 酶具有 5'→3' 外切核小体

酸酶活性，酯化探针

优势

 一个。 对目标序列的高度特异性

b. 设计比较简单------与目标序列的某个区域互补 

C。 良好的重复性 

d. 支持多种荧光设计

缺点

 一个。 委托公司做标，价格更高

b. 不容易找到背景低的探针

Real-time PCR在科研和临床应用中的应用

• 量化——DNA 量化

- RNA 定量

• 定性 SNP 分析

- 基因型分析

-RNA变异分析

- 熔解曲线分析

- 消极和积极的认同

实时PCR-定量数据处理简介

1) 起始模板编号的精确拷贝数的绝对定量，一般使用标准曲线。

A。 至少 5 个不同含量梯度的标准品，包括未知样品的含量

b. 每点重复 3 次

C。 添加 NTC 以检查可能的污染

d. 将未知样品的Ct值代入公式得到初始含量X025

2) 相对定量测定不同处理样品中目的转录本之间的基因表达差异

不同的。

(1) 相对值(ΔCT)——未对内参基因进行归一化——以质量单位为标准

– 起始材料的准确定量

(2) 均质化表达——考虑初始样本的差异——以内参基因为标准——a

或在所有测试样本中一致表达的多个已知参考基因

竞争性PCR

•竞争性PCR是将目的基因与参考标准在同一反应管中进行共扩增，使用参考

测试标准用作对照以显示特定目标 DNA 或 RNA 分子的相对浓度。

• 竞争性PCR有效控制了不同反应管之间扩增效率的差异。

竞争性 PCR - 理论基础

PCR扩增过程中，PCR产物量用公式Y=A(1+R)n表示，其中Y代表PCR产物量，A代表初始模板量，R代表PCR扩增效率，n代表PCR，当PCR扩增效率相同时，PCR产物量与起始模板量成反比。 —相似的基因序列，相同的质粒，相同的质粒结合位点，相同的扩增效率。 在最终的混合PCR产物中，待分析样品与竞争底物终产物的比值直观地反映了两者初始状态下核苷酸浓度的比值。

多重 + 竞争性 PCR - 优势

A。 高通量：每个反应孔可同时监测10个基因；

b. 经济性：适用于大样本多基因同时测定，大大缩短实验周期，提高

实验效率。

C。 检验区分度高：可有效区分低至15%的表达量差异；

d. 良好的重复性：已知 RNA 含量递增稀释后的多重表达分析

线性关系好 R2>0.99；

e. 准确度高：目标/参考基因片段与内参基因片段序列基本一致

为保证最终扩增产物与初始模板量比的真实反应，一个或多个参数

光基因与被测基因在同一管内反应，各基因表达量良好。

使用竞争性 PCR 进行准确测定。

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