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自90年代探针问世以来，尽管新型荧光探针技术层出不穷，但探针技术在定量PCR领域依旧占据着重要地位，成为众多实验研究人员定量检测的首选工具。这主要得益于探针相较于SYBR荧光染料，具备序列特异性，仅与互补区域结合，且荧光信号与扩增的DNA拷贝数呈一一对应关系，从而确保了其特异性和灵敏度。此外，探针技术条件优化相对容易，且相较于杂交探针，仅需设计一条探针，从而降低了探针设计的成本和复杂性，同时也能满足基本的定量PCR需求。当然定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

通常，定量PCR的实验步骤包括：首先，寻找并比对目标基因；接着，设计并合成相应的探针和引物；然后dnastar引物设计，准备反应体系；确定反应参数；进行多次实验，不断优化实验条件；最终，收集曲线数据，并与标准曲线进行比对，再进行重复验证。

在第一步中，我们需对目标基因进行查找和比对，这一过程可通过使用NCBI序列数据库等工具来实现——相信很多人在分析测序报告时都曾操作过这一步骤。在此过程中，我们必须确保所分析的序列位于一个重叠群中，即染色体上相邻的DNA片段存在重叠的情况。

在第二步中，若其他条件保持不变，那么引物探针的设计便成为了定量PCR能否成功的关键环节。基于多年的实践经验，我们可以归纳出以下几个基本原则：

总体原则

* 先选择好探针dnastar引物设计，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所挑选的序列需具备极高的独特性，最好选取那些二级结构最简单的扩增片段——鉴于二级结构会显著影响反应速率，并可能妨碍酶的扩增作用。因此，建议首先进行二级结构的检测。若检测结果显示无法避免二级结构的存在，那么就需要适当提升退火温度。

扩增长度不宜超过400碱基对，而理想状态则是在100至150碱基对之间。扩增片段的长度越短，实现有效的扩增反应就更为简便。同时，较短的扩增片段更有利于确保分析结果的一致性。

维持GC比例在20%至80%的范围内，GC富集区域更易引发非特异性反应，进而可能引起扩增效率的下降，并在荧光染料分析过程中出现非特异性信号。

为确保作业的效率与一致性，我们应当尽量避免使用重复的核苷酸序列，特别是G这一碱基，必须避免出现连续四个G的情况。

对引物与探针进行相互配对检验，目的是为了防止二聚体及发卡结构的产生。

引物设计原则

* 序列选取应在基因的保守区段

在构建引物时，应确保其自身或与其他引物之间不产生四个或更多连续的配对，同时也要防止引物自身形成环状发卡结构。

典型的引物长度介于18至24个核苷酸之间。引物的长度必须足够，以确保序列的独特性，同时减少其在非目标序列位置出现的概率。然而，引物长度超过24个核苷酸并不代表其特异性会更高。较长的序列有可能与错误的配对序列发生杂交，这会降低其特异性，并且与短序列相比，杂交速度较慢，进而减少了产量。

Tm值介于55至65摄氏度之间，这一范围得益于60摄氏度时核酸外切酶的活性达到峰值，同时，GC含量保持在40%至60%的区间。

* 引物之间的TM相差避免超过2℃

在合成引物时，应确保其3'端不使用碱基A，同时也要注意避免3'端出现三个或更多连续一致的碱基序列。

* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

* 探针技术要求片段长度在50bp－150bp

* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针设计原则

* 探针位置尽可能地靠近上游引物

探针的长度应控制在15至45碱基对之间，其中20至30碱基对的长度最为理想，这样可以确保其与目标序列的结合具有高度的特异性。

* 检测探针的DNA折叠和二级结构

Tm值一般在65至70摄氏度之间，通常情况下，它比引物的Tm值高出5至10摄氏度，这个增量至少应为5摄氏度，同时，GC含量介于40%到70%之间。

探针的5'端不宜选用G鸟嘌呤，因为这种碱基会导致淬灭效应，并且即便被剪裁下来，这种淬灭效应依然存在。

在整条探针的组成中，碱基C的比例显著超过G——若G的比例偏高，将导致反应效率下降，此时宜选用与之互补的另一条链作为探针。

为确保引物探针的特异性，我们建议在blast数据库中进行序列比对，以验证设计。若发现存在非特异性互补区域，则需对引物探针进行重新设计。

MGB 探针设计

探针的5’端应尽量避免含有G碱基，即便探针被水解成单个碱基，与报告基团相连的G碱基依然能够有效淬灭该基团的荧光信号。

* Tm值应为65-67℃。

* 尽量缩短 MGB探针，但探针长度不少于13bp。

在构建序列时，务必减少碱基的重复，特别是G碱基的重复，应尽量避免连续出现四个或更多个G。

一般来说，一旦MGB探针出现碱基的变异，即可被检测出来（此时MGB探针无法与目标序列进行结合，因而不会发出荧光信号）。因此，在执行SNP检测过程中，为了能够成功识别变异的子序列，即确保MGB探针不与目标序列结合且不产生荧光信号，我们应将探针的突变位置尽量设置在中间三分之一区域内。

注意：

为了实现上述四个条件，探针的突变位置可以移向3'端，但必须保证突变位置至少在3'端前方两个碱基之外（也就是说，探针的最后两个碱基必须是严格不变的），这样才能进行SNP检测。相反，如果进行类似的检测，需要寻找的是保守序列区域，此时探针中不应含有突变位置。即便探针长度仅有13个碱基，它也不可能是完全保守的。存在数处变异，变异位置需位于探针的5'端附近，即便发生变异，探针依然能与目标序列进行杂交，从而生成荧光信号。此外，还可以采用设计简并探针的策略，即便在变异情况下，依然能够检测到变异的存在。

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