在公众号后台回复【三部曲】，免费领取价值399元的【SCI写作必备三部曲】。

RT-PCR引物设计需要遵循的主要原则是：

(1)引物应设计在核酸保守区域内并保持特异性；

(2)引物长度一般为15-30bp，GC含量一般为40%-60%；

(3)引物模板序列的Tm值应维持在72℃左右；

(4)引物3'端的碱基满足四个“不”：

一“否”：无A，二“否”：不超过3个连续碱基（如GGG和CCC），三“否”：无互补、二聚体或发夹结构，四“否”：无在密码子位置终止3；

(5)碱基随机分布dnastar引物设计，且引物本身与引物之间连续四个碱基不互补； 6、引物3'端ΔG值较低，5'端和中间ΔG值较高，呈正弦曲线形状。

PCR引物设计常用的软件有“Oligo”、“”、“”等，操作相对复杂，对于科研新手来说较难上手。

今天给大家介绍一种适合新手的引物设计方法，非常适合刚入门的新手。

网站1：

网站2：

打开网站，单击“全部”下拉选项，然后选择“基因”。

在框中输入目标基因（以Akt为例），如图搜索Akt，可以看到显示了很多Akt基因，选择对应的物种，如mouse（家鼠）、rat（大鼠） ）、人类（人类）等。这里需要选择小鼠（家鼠）品种的Akt。

打开Akt1，下拉网站，在NCBI()中选择mRNA和(s)，点击.1，复制Akt1的基因序列。

如何设计引物？

打开（生工官网），点击技术服务dnastar引物设计，点击 Free ，将之前复制的基因序列复制进去，根据提示检查（以小鼠Akt基因为例，如下），提交引物设计清单。

如何检查引物设计结果？

点击引物设计列表查看结果即可看到Akt基因设计的引物。 在合成引物之前，我们还需要对设计的引物进行BLAST验证，并利用软件模拟来观察它们是否能够扩增我们的目的基因。 。

如何进行引物的BLAST验证？

打开网站，下拉，点击-BLAST，复制之前设计的引物，将选项改为house mouse(taxid:10090)（根据品系选择，本例为小鼠品系），最后点击Get进行BLAST验证（结果需要等待几秒钟），观察结果，如果验证得到的基因是Akt，即设计的引物符合要求，可以用于PCR实验。

以上是使用两个网站设计引物的步骤。 是不是很简单呢？ 希望对刚接触实验室的朋友有所帮助！

【医学研究嘉年华】限时福利

双11闪购9.9元起

消费满300即可获赠定制笔记本

50+免费好课程

小狗科研公开课SP限时招募会员

只剩下最后2天了

长按扫描二维码了解会员权益

如有侵权请联系删除！