PCR（Chain），英文翻译为聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，可以看作是在体外特殊的DNA复制。 1983年，日本首先提出了这一想法，并于1985年发明了聚合酶链式反应，这是一种简单的DNA扩增方法，这意味着PCR技术的真正诞生。 截至目前，PCR技术已广泛应用于生命科学、医学研究、基因工程、法医学、考古学、人类学等领域。

PCR原理

PCR技术的基本原理与DNA的自然复制过程类似，其特异性取决于与目标序列两端互补的寡核苷酸质粒。 PCR由变性-固溶-延伸三个基本反应步骤组成： ①模板DNA变性：模板DNA加热至93℃左右一定时间后，双链DNA解离，成为单链; ②模板DNA与质粒固溶（复性）：模板DNA加热变性成单链后，温度降至55℃左右，质粒与模板DNA单链的互补序列配对； ③引物延伸：DNA模板-质粒结合物72℃，在DNA聚合酶（如聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，以目的序列为模板，根据核苷酸互补配对原理，合成引物新的半保留复制链与模板DNA链互补，重复这个过程，可以获得更多的“半保守复制链”

PCR质粒设计的基本原则

①引物宽度：15-30bp，通常在20bp左右。

②引物核苷酸：G+C浓度为40-60%。 如果G+C太少，扩增效果不好，如果G+C太多，则容易出现非特异性条带。

③ 两个质粒之间不应存在互补序列，特别是防止3'端互补重叠。

④ 引物与非特异性扩增区域序列的同源性不应超过70%，且质粒3'端的8个连续核苷酸在待扩增区域外不应有完整的互补序列dnastar引物设计，否则很容易造成非特异性扩增。

⑤ 引物的5'端可以进行修饰。 如添加限制性酶切位点、引入突变位点、使用生物素、荧光物质、地高辛标记、添加其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

PCR反应特点

常见问题及解答

1、问：没有出现放大带？

答：当酶和质粒质量良好时，不会出现扩增条带。 很有可能是标本的消化过程和模板核苷酸提取过程出现了问题。 例如，模板富含异源蛋白，在提取制备模板的过程中损失过多，或者吸入酚类物质。 因此，为了配制出有效、稳定的消化处理液dnastar引物设计，程序不能随意修改。

2. Q：PCR扩增条带与目的序列条带一致，但条带更整齐，色温更高（假阴性）？

答：假阴性的原因如下：①引物设计不当：所选扩增序列与非目的扩增序列具有同源性。 进行PCR扩增时，扩增的PCR产物是非目标序列。 为此，需要重新设计质粒。 ② 目标序列或扩增产物的交叉污染。 这些假阴性可以通过小心轻柔地避免将目标物吸入移液器或从离心管中溅出来解决。 除酶和不耐低温的物质外，所有试剂或设备均应采用高压灭菌。 所有离心管和进样枪头均应使用一次。

3. Q：出现非特异性扩增条带？

答：出现非特异性条带的原因：一是质粒与目的序列不完全互补，或者质粒聚集产生二聚体。 二是Mg2+离子含量过低，退火温度过高，PCR循环次数过多。 第三是酶的质量和数量，过多的酶有时会造成非特异性扩增。 对策是：必要时重新设计质粒。 减少酶的用量或改用其他酶来源。 增加质粒用量，适当减少模板用量，减少循环次数。

4、问：是否有点状拖拽或拖尾现象？

答：原因往往是酶用量过多或酶质量差、dNTP含量低、Mg2+含量低、固溶温度高、循环次数过多等。 对策是：①减少酶的用量，或更换其他来源的酶。 ②降低dNTP含量，适当降低Mg2+含量。 ③增加模板量，减少循环次数。

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