前两期的文章你看了吗？还没看的话这里有！

关于样本品质及操作失误引发扩增曲线异常的文献，我已经阅读过了，觉得写得相当精彩。

不过，我最近进行的实验中，熔解曲线出现了两个峰值，能否请您帮我进行一下分析，看看是什么原因导致的呢？

没问题，可能是引物问题，你把结果发过来。

小阿米

小阿米再次带来了新的话题！在前两期中，我们讨论了由于样本质量问题和操作失误导致的曲线异常情况。今天，我们要探讨的是引物的特异性问题。在qPCR实验中，引物是至关重要的。我们可以参考Bank和已发表的文献中的验证结果来选择引物，或者根据自己感兴趣的基因序列来设计引物。那么，如何设计引物才能避免陷入陷阱呢？让我们一起来探讨这个问题。

熔解曲线主峰后出现小峰，说明反应过程存在非特异性扩增

熔解曲线主峰前出现小峰，说明在反应过程中产生了引物二聚体

在qPCR实验过程中，尤其是采用SYBR Green染料技术时，我们最担忧的是可能出现的非特异性扩增现象dnastar引物设计，这通常表现为熔解曲线中存在多个Tm值。若在熔解曲线的最高峰之前观察到次级峰，这表明反应中生成了引物二聚体；对此，可以通过减少引物浓度或适当提高退火温度来调整；若调整反应条件后二聚体依然存在，那么就需要重新设计引物；而若次级峰出现在主峰之后，则暗示着发生了非特异性扩增，此时同样需要重新设计引物。

引物设计原则

为确保引物的独特性，其与非特异性扩增序列的相似度需控制在70%以下。

扩增得到的产物无法形成高级结构dnastar引物设计，但我们可以借助web等工具，对RNA的二级结构进行预测和估算。

引物长度通常介于15至30个碱基单位；碱基分布需保持随机性；G+C比例应在40%到60%的范围内。

引物本身不得含有连续的四碱基互补序列；同时，引物相互之间亦不应存在连续的四碱基互补序列。

引物的5'端允许进行修饰处理；而3'端则不宜进行修饰；此外，还需注意引物的3'端位置，避免与密码子的第三位碱基相冲突。

引物设计软件

引物设计软件的主要作用体现在两个核心功能上：首先，它具备对引物进行详尽的分析与评估的能力；其次，它能够自动进行引物的搜索操作。

该软件堪称当前功能最为全面且操作简易的工具，与此同时，诸如、Omiga等其他软件亦具备自动寻找引物的特性。

为了确保引物效果显著，必须依托自动搜索的同时，辅以细致的人工评估。

推荐将Oligo工具与相关软件相结合，以实现自动化的搜索过程；随后，利用Oligo进行详尽的分析与评估；通过这样的方式，能够迅速设计出具有高成功率的引物。

如有侵权请联系删除！