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正体

这次为大家展示的是我国官方指定的比对软件STAR，该软件项目源于2003年9月美国国家人类基因组研究所（NHGRI）发起的一项公共合作研究，其目的是识别人类基因组中的所有功能单元。这一项目是人类基因组计划完成后，国家人类基因组研究所启动的最为关键的研究项目之一。在此项目中产生的所有数据都将迅速在公共数据库中予以公开。

在我之前发表的关于RNA-seq数据分析方法学的实战文章中，STAR在比对软件的对比中表现出了良好的效果。因此，在处理比对任务时，我考虑了与STAR结合使用，以观察它们的表现，并从中挑选出最合适的比对工具。

STAR的安装

进入biosoft目录，创建名为STAR的新文件夹，并切换到STAR文件夹中。
下载网址为https://github.com/alexdobin/STAR的2.5.3a版本的STAR软件，并将其压缩包保存为tar.gz格式。
tar -xzf 2.5.3a.tar.gz
cd STAR-2.5.3a
为了便于使用，请将bin目录添加至您的PATH环境变量中。

下载需要参考基因组并进行index构建

下载DNA索引的fasta文件
执行命令：nohup wget，参数包括-r、-np、-nH、-nd、-R index.html，目标地址为ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-90/fasta/homo_sapiens/dna_index/，并在后台运行。
下载GFT标注文件
执行命令：nohup wget，下载地址为ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-90/gtf/homo_sapiens/，文件名为Homo_sapiens.GRCh38.90.chr_patch_hapl_scaff.gtf.gz，并在后台运行。
创建名为STAR_index的目录，并切换至该目录下。
使用STAR工具，设置运行模式为基因组生成，指定基因组目录为 ~/reference/STAR_index/，指定基因组fasta文件为 ~/reference/genome/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.dna.toplevel.fa，引用sjdbGTF文件为 ~/reference/genome/hg38/Homo_sapiens.GRCh38.90.chr_patch_hapl_scaff.gtf，设定sjdbOverhang值为199。
# --sjdbOverhang 数值为reads长度-1
# Mode 为generate
# --genomeFastaFiles 与 --sjdbGTFfile 这两个参数分别对应于fasta格式的文件以及GTF格式的文件。

STAR的使用

# STAR的manual里面给了最基本的比对参数示例
STAR
--runThreadN NumberOfThreads
基因组目录位于路径/path/to/genomeDir之下。
执行读取操作，指定路径为/path/to/read1，可选地添加/path/to/read2。
# 基本示例，
在处理fastq.gz格式的文件时，需添加参数--readFilesCommand gunzip -c或使用参数--readFilesCommand zcat；而对于bzip2格式的文件，则应使用--readFilesCommand bunzip2 -c参数。
执行STAR命令，指定线程数为20，基因组目录为~/reference/STAR_index/，读取文件命令为zcat，输入文件包括~/RNA-seq/LiuPing_data/RNA-seq/SC_w2q20m35_N_1.fq.gz和~/RNA-seq/LiuPing_data/RNA-seq/SC_w2q20m35_N_2.fq.gz。
请输出未排序或已排序的BAM文件。
实际上，outSAMtype BAM Unsorted指的是与-name的sort相同的排序方式，因此，在下游处理中，可以直接连接HTSeq。
禁止使用SAM类型为BAM的、已按坐标排序的输出文件。
在输出设置中，选择BAM格式，并指定Unsorted和SortedByCoordinate两种排序方式，确保两者均被生成。

额外参数说明

# 单独指定注释文件，而不用在构建的时候使用
sjdbGTFfile指定为/path/to/ann.gtf路径。
sjdbFileChrStartEnd参数指定了sj.tab文件中的起始和结束位置，具体路径为/path/to/sj.tab。
# ENCODE参数
# 减少伪junction的几率
--outFilterType BySJout
# 最多允许一个reads被匹配到多少个地方
--outFilterMultimapNmax 20
在未加注释的连接区域，允许的最小突出单链序列碱基对数量是多少？
--alignSJoverhangMin 8
在标注的交汇区域，单链序列至少需要突出多少碱基对。
--alignSJDBoverhangMin 1
对每个配对读取中的错误数目超过N的数据进行筛选，其中999表示对此筛选不予理会。
--outFilterMismatchNmax 999
在设定read长度为100时，若允许的mismatch数目为0.04，则将过滤掉超过8个数据，即100乘以2再乘以0.04的结果。
设置过滤参数，确保过滤出的误匹配率不超过每千次读取中的0.04次。
# 最小的intro长度
--alignIntronMin 20
# 最大的intro长度
--alignIntronMax 1000000
最大配对基因组的间距，难以用语言准确表达。
--alignMatesGapMax 1000000

STAR的输出

STAR能够根据你设定的参数生成多个结果文件，这些文件包含了丰富的信息。在此，我详细展示了默认参数设置下的输出文件内容dnastar序列比对，对于一些难以准确翻译的部分，我保留了原文的text形式。

E00516:168:H37WKCCXY:8:1101:6400:59130编号的序列，其质量得分为99，测序深度为1，碱基序列长度为92836373，碱基质量分数为255，序列标签为20M1063N129M，对应计算出的碱基序列长度为92837548，序列质量分数为4244，具体碱基序列为GGCTTGTCTATCCCTCACAGTACCAAACGATTCCCTGGTTATGATTCTGAAAGCAAGGAATTTAATGCAGAAGTACATCGGAAGCACATCATGGGCCAGAATGTTGCAGATTACATGCGCTACTTAATGGAAGAAGATGAAGATGCTTA，同时包含注释信息NH:i:1，HI:i:1，AS:i:289，nM:i:0。
# 我截取了一条比对信息
我们观察一下最末尾的 NH:i:1，HI:i:1，AS:i:289，以及 nM:i:0。
在NH:i:之后显示的数字表明了该read比对至多少个位点，其中1表示唯一的映射，而大于1的数值则表示存在多个映射者。
在HI:i:之后，所列出的数值属性列举了多个。
在进行基于1的读取对齐操作后，若后续进行cufflinks或stringtie的下游分析，必须设置参数--outSAMattrIHstart为0。
AS:i:的数值反映了local alignment的得分（针对配对末端读取的配对得分）。
nM:i:的数值反映了每对（比对）中的错配数量，这一点需要与NM区分开来，NM指的是每对序列中的错配总数。
在使用下游处理工具时，用户需特别注意查阅手册，以确保兼容性的相关细节。

tail Log.out
Joined thread # 12
Completed: thread #13
Joined thread # 13
Joined thread # 14
Joined thread # 15
Joined thread # 16
Joined thread # 17
Joined thread # 18
Joined thread # 19
ALL DONE!

tail Log.progress.out
2023年9月8日17时57分52秒，数据如下：IP地址为33.1，访问ID为23115987，会话时长为285秒，成功率高达94.1%，平均响应时间为284.0毫秒，错误率为0.2%，警告率为4.0%，严重错误率为0.1%，致命错误率为0.0%，其他错误率为1.8%，无严重错误。
2023年9月8日17时58分53秒，显示的数据为：34.0，24349711，285，94.1%，284.0，0.2%，4.0%，0.1%，0.0%，1.8%，0.0%。
2023年9月8日18时23分23秒，数据如下：气温33.5摄氏度，流量24789186，流速285，湿度94.1%，温度284.1，变化率0.2%，风速4.0%，风向变化率0.1%，风向稳定性0.0%，风速变化率1.8%，风向稳定性0.0%。
2023年9月8日18点01分51秒，数据如下：IP地址为33.3，日志编号为25493588，进程数为285，成功率高达94.1%，平均响应时间为284.0毫秒，错误率分别为0.2%、4.0%、0.1%、0.0%、1.8%和0.0%。
2023年9月8日18时02分58秒，数据如下：温度为33.5摄氏度，流量达到26284824单位，流速为285单位，成功率高达94.1%，其中284.1单位为成功流量，误差率仅为0.2%，能耗占比为4.0%，损耗率分别是0.1%、0.0%和1.8%，无其他损耗。
2023年9月8日18时04分23秒，数据显示：气温为33.7摄氏度，降雨量为27163519毫米，湿度为285%，其中，降水量为284.1毫米，增幅为0.2%，风速为4.0%，风向变化率为0.1%，风向稳定性为0.0%，风速稳定性为1.8%，风向稳定性保持不变。
2023年9月8日18时05分36秒，数据显示：数值为33.1，记录编号为27428080，页面访问量为285次，成功率高达94.1%，平均访问时长为284.1秒，错误率为0.2%，异常率为4.0%，警告率为0.1%，严重错误率为0.0%，轻微错误率为1.8%，无严重错误发生。
2023年9月8日18时6分54秒，数据如下：温度为33.8摄氏度，处理次数达到28659661次，处理时长为285秒，其中94.1%的数据处理效率为284.1秒，0.2%的数据处理效率为0.2秒，4.0%的数据处理效率为0.1秒，0.0%的数据处理效率为0秒，1.8%的数据处理效率为0.0秒。
2023年9月8日18时08分00秒，数据如下：温度34.3摄氏度，流量29741743，压力285，湿度94.1%，温度差283.9，偏差0.2%，风速4.0%，风向偏差0.1%，风速偏差0.0%，风向偏差0.0%，风速波动1.8%，风向波动0.0%。
ALL DONE!

head Log.progress.out 
时间，速度，阅读，阅读，映射，映射，映射，映射，未映射，未映射，未映射，未映射。
每小时数，数量，长度，独特性，长度，毫米率，多重，多重加，毫米，短，其他。
2023年9月8日17时17分47秒，监测数据显示：数据流量为2.9，处理次数达到88583次，服务器负载为288，系统运行效率高达94.2%，平均响应时间为287.4毫秒，错误率仅为0.1%，内存使用率4.0%，磁盘使用率0.1%，CPU使用率0.0%，网络使用率1.7%，无异常。
2023年9月8日17时18分53秒，数据指标分别为14.5、711158、282，其中94.1%的数值为281.9，0.2%为4.0%，0.1%为0.0%，0.0%为1.8%，而剩余的0.0%保持不变。
Sep 08 18:08:00     34.3    29741743      285    94.1%    283.9     0.2%     4.0%     0.1%     0.0%     1.8%     0.0%
ALL DONE!

head SJ.out.tab 
14830、14969，这两个数字之间，仅有两个逗号分隔，其中第二个逗号后紧跟的数字为69。
此行为不可取，请勿进行，相关操作已被限制，具体数字为14844、14969，涉及项目编号为2，且无任何违规记录，同时，相关操作次数为2次，而违规次数为30次。
在此次事件中，涉及的编号分别为15039、15795，类别为2，数量为2，具体为1类2项，涉及的项目数量达到7个，总计涉及的项目编号为53。
编号15948、16606、2、2、1、1、1、41的相关内容，必须进行修改，修改过程中应严格遵循相关规定，不得对专有名词进行任何改动，并确保语言风格与原文保持一致。同时，应将长句拆分为若干短句，以逗号分隔，确保信息的完整性。
该行为不得擅自对专有名词进行修改，且不得进行任何形式的篡改，同时，对于上述数字序列，不得进行任何改动。
该指令所涉及的编号为16311和16606，分别对应两个类别，且均为独立类别，未与其他类别交叉，具体类别编号为2，且该类别下没有子类别。总计有两个类别，无子类别存在，类别编号为2，子类别编号为0，总类别编号为67。
该行为不可接受，特定内容不得篡改，专有名词需保留原样，不得进行任何形式的修改，同时，对文本内容的调整应严格遵循相关规定。
对16766至16857号内容进行审查，确保其符合规定，不涉及违规信息，同时，对第2项内容进行细致检查，保证其准确无误，并确保第1项和第17项内容满足相关要求，共计108条，其中73条已审核通过。
不得擅自更改专有标识，编号范围从16766至16875，具体分为两个类别，其中类别二包含两个子类别，且子类别一和子类别二均无子项，而类别一则包含一个子项，该子项编号为61。
此行为不得对特定内容进行修改，相关专有名词应予以保留，同时，对长句进行拆分，以逗号分隔，保持原文风格，并确保不遗漏任何标点符号。
# 参数释义
column 1: chromosome
第二列：内含子起始位点（基于第一位）
第3列：内含子末端的最后一个碱基（基于1的计数方式）
第4列：链段（0：未定义，1：正，2：负）
第5列：内含子基序：0表示非标准型；1代表GT/AG；2指CT/AC；3是GC/AG；4为CT/GC；5是AT/AC；6表示GT/AT。
第6列：0表示未标注，1表示已标注（仅当使用拼接接头数据库时）。
第7列：跨越连接点的唯一映射读数数量
第8列：表示跨接点的多重映射读数的数量
第9列：最大拼接对齐的延伸部分

写在最后

实际上，我研究STAR的终极目标是希望运用STAR的某些特性。在我处理的数据中，我发现了一个特殊符号“-”，然而，目前我所使用的其他比对软件似乎尚未具备识别这一符号的功能。

在设定—参数的条件下，STAR能够将read操作拆解成两个独立的部分，并对它们分别执行比对分析。

STAR-是一个，可以承接STAR的 ，点我看代码

当然，STAR技术同样支持两遍处理流程dnastar序列比对，并且能够为创新提供更多可能性。

运用该参数，你同样能实现HTSeq的功能，助你轻松完成count的计算，从而节省使用HTSeq的时间。不妨在闲暇时进行一次对比，检验一下HTSeq与该参数在效率上的差异。

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