在PCR的整个流程中，引物扮演着至关重要的角色。它必须与目标DNA精确匹配，避免与任何非目标DNA发生结合。同时，PCR的高灵敏度需求意味着DNA聚合酶必须能够与引物高效地延伸。因此，引物的设计质量直接影响到PCR实验的结果。

一、PCR引物设计原则

1、引物长度一般在15-30bp

引物长度通常介于15至30个碱基对之间，其中18至27bp的使用频率较高，然而其长度不应超过38bp，否则其延伸温度将超过74℃，这会使Taq DNA聚合酶的反应条件变得不适宜。

2、引物GC含量一般为40%-60%

引物的GC含量通常介于40%至60%之间，其中45%至55%的比例较为理想。GC含量若过高或过低，均会对反应的启动产生不利影响。同时，上下游引物的GC含量以及Tm值应尽量保持相近。

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右

复性条件在72℃附近达到最佳，这一温度范围至少应涵盖55℃至80℃。计算Tm值的方法众多，例如依据公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)进行计算，而在Oligo软件中，所采用的方法为最邻近法。

4、引物3’端的碱基一般不用A

引物3'端的碱基通常不采用A，这是因为A在错误位点引发的效率相对较高。

若引物3'端存在三个或更多连续的碱基，例如GGG或CCC，那么错误引发的几率便会相应提升。

引物3'端若存在互补序列、二聚体结构或发夹形态，均可能引发PCR反应的失败。

若要扩大编码区域，需注意引物3'端的位置，不宜直接终止于密码子的第三个碱基，因为该位置上的碱基容易发生简并现象，这可能会对扩增的特异性和效率造成不利影响。

8、引物5’端可以修饰

引物5’端的序列对PCR反应的影响并不显著，所以它通常被用于引入修饰位点或是标记物。

碱基需均匀排列，同时确保引物本身以及引物之间不出现连续的四个碱基互补配对。

模板内部引物序列应尽量避免高度相似，尤其是3'端的相似性不宜过高，因为这样很容易引发错误。为了减少引物与模板之间的相似性，一个有效的方法是确保引物中的四种碱基分布是随机的，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶的情况。同时，引物本身也不应含有互补序列，否则引物可能会自身折叠形成发夹结构，导致其复性。这种二级结构的存在会阻碍引物与模板的复性结合，因为空间位阻效应。引物本身不能含有连续的四个碱基互补序列。同时，两个引物之间也不应存在互补性dnastar引物设计，特别是要避免3'端的互补重叠dnastar引物设计，以免形成引物二聚体（包括Dimer和Cross Dimer）。此外，引物之间也不应出现连续四个碱基的互补。若引物二聚体及发夹结构无法避免，则应努力控制其G值，确保其不超过4.5kcal/mol。否则，这可能导致引物二聚体产生，同时也会降低引物的有效浓度，进而影响PCR反应的正常进行。

引物的ΔG值理想状态是呈现出正弦波曲线，具体表现为3'端的ΔG值偏低，而5'端以及中间区域的ΔG值则相对较高。

自由能ΔG的数值揭示了引物与模板配对的紧密程度，通常而言，理想的引物ΔG值应呈现类似正弦波的曲线，这意味着3'端的ΔG值较低，而5'端及中间区域的ΔG值则相对较高。具体来说，3'端的ΔG值应保持较低，且其绝对值不宜超过9。若引物的3'端ΔG值过高，便有可能在非特异性结合位点形成双链结构，进而触发不正确的DNA聚合反应。

引物需在核酸的保守区域进行设计，且应具备明确的特异性。同时，引物与任意非特异性扩增序列之间的同源性应控制在70%以下，且不应存在连续8个互补碱基的完全同源。

二、Real Time PCR引物设计原则

实时PCR所使用的引物与常规PCR引物的设计标准存在差异。在PCR过程中，目的是使目标基因按照预期的数值进行复制，这就对非特异性的反应以及引物二聚体的形成提出了较为严格的要求。

三、常用的引物设计软件

“该产品”，“缩写为Oligo”，“NTI Suit”，“另一个名称为”，“Omiga”以及“”。

下面详细介绍一下 5.0的用法：

1、通过File下的New或Open载入需要设计引物的序列

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2、进入到程序的引物设计窗口

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3、点击，则出现新的界面

在新界面上，您需要设定设计引物所需的相关参数。这些参数主要包括五个关键设置环节。

在第一个环节中，我们需要挑选PCR引物、测序引物以及杂交探针，若计划进行PCR实验，请勾选第一个标记为“PCR”的选项。

第二个区域涉及搜索方式，通常我们在寻找引物时，会采取成对的方式进行搜索，因此通常会选择“成对”这一选项。

第三个位置涉及正负链的特定区间以及生成产物的尺寸和长度，这需根据个人需求来确定，它与实验目标紧密相连，需要具体问题具体分析。第四个方面是引物的长度及其正负波动幅度，通常引物的长度保持在18至27个碱基对之间。第五个环节是选择操作模式，通常选择默认设置。完成上述设置后，点击“OK”按钮，系统将自动跳转至新界面。

4、点击“OK”，出现如下新界面

评估结果会根据得分从高到低进行排序，通常我们会优先选择得分较高的结果。评分是评价引物质量的一个重要指标，通过评分系统，我们能够对引物进行全面的评估，并在引物之间进行对比和选择时提供有力的依据。若我们仅需寻找正向或反向的引物，则可点击“Sense”或“Anti-sense”按钮进行筛选。

5、点击评分高的结果，就可以显示引物的详细信息，如下图。

该图左上角的两个按钮

这些分别标识了正向与反向的引物。图中中央区域详细展示了引物的得分、定位、长度、熔解温度（Tm值）、GC含量以及自由能等关键数据。图的最下方区域则揭示了正反引物是否形成了发夹结构、二聚体、错配以及引物间二聚体等状态，其中红色符号表示存在这些情况。点击操作可进一步查看详情。

我们能够观察到这些结构的详细信息，诸如它们的起始点，以及由此产生的自由能。

若对检索到的引物感到不满足，我们可手动对其位置进行修改，并且还可以通过点击操作进行相应的调整。

对引物进行编辑的按钮，如上图所示，允许我们进行碱基的增加、删除或调整，以便寻找到最理想的效果。

7、最后将设计好的引物导出或复制出来。

四、推荐几款在线引物设计网站

1、

http://.ut.ee//

一个广泛使用的PCR引物设计程序。

2、-BLAST

请访问https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/，在该网页上选择“BLAST”功能。

此在线工具旨在合成针对聚合酶链反应（PCR）的特定寡核苷酸引物，并且它还融合了NCBI的Blast查询功能。

3、

http://..uni-.de//

提供一个在线的简并引物设计工具，基础是同源基因。

4、

http://www..nl/cgi-bin//.cgi

5、

http://.enzim.hu/?m=

强烈推荐设计针对增强亚硫酸氢盐处理过程的高冗余序列的引物，同时采用高效的ePCR技术以规避非特异性PCR产物的生成。

6、Web

https://www..org/cgi-bin/web-

斯坦福大学提供的在线引物设计软件,酵母基因组数据库提供。

7、

http://www..de/

快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件

注：本文转自知乎，作者 。植物分子研究整理。

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