提示：

1、基因测序可以诊断和消除污染；

2.测序和序列比对可用于确定菌株类型和亲缘关系；

3.生活，。

在之前的病原测定技术推文中介绍过，PCR检测是确定病原体的神器。 但PCR阴性条带可能是非特异性扩增，需要测序验证； 可诊断基因测序，排除污染； 但更重要的是，测序和序列比对可用于确定菌株种类和相关性。 我们先不谈目前流行的NGS（next, deep ）诊断方法，只介绍常规PCR后的直接测序或克隆测序。

测序方法主要使用物理切割法（MAxam-）——基本不用了

以及在 DNA 链末端终止合成（方法）。 它是基于双脱氧内质网核苷酸（ddA、ddT、ddC和ddG）加入DNA链后会停止延伸的特点。 根据从固定点开始的碱基，随机在一个特定的核苷酸上悬浮，但在每个核苷酸旁边都有荧光标记，形成一系列以A、T、C、G结尾的四组粗细不同的碱基，然后通过尿素变性 PAGE 凝胶电泳测量。 因此，一种获得可见 DNA 核苷酸序列的方法。

该方法经过优化后，使用荧光代替放射性同位素标记是人工DNA序列分析的基础。 手动DNA测序仪可以用不同的荧光分子标记四种双脱氧碱基，然后进行测序反应。 反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，用四种激光在不同大小的DNA片段上打出荧光分子。 使其发出四种不同波长的荧光，测量装置采集荧光信号，据此确定DNA核苷酸的序列。

说了这么多，虽然今天实验室的男小鸡基本都是打电话叫测序公司的小哥来冷冻室拿样本（一般是PCR产物），公司会负责跑胶鉴定回收排序。 最快第二天，序列将通过电子邮件发送。

测序结果返回后如何分析病毒的亲缘关系，我的朋友dnastar序列比对，我们实验室检查组组长张新辉写了详细的操作，并做了一些修改，分享如下：

序列分析软件种类繁多，常用的有软件和软件包。 用于查看测序峰，判断测序质量，截取有效序列片段； 分为测量结果序列比较过程中常用的、、、、等多个软件。

下面以in-line场景描述序列分析比对的过程：

一般样本送到测序公司几天后，就会收到测序结果，如图：

下载短信中的附件

解压后你会发现一个检查用的会有两种格式的文件

AB1后缀的文件是测序结果的电泳图，可以用软件打开，通过电泳图可以知道测序结果的准确度和精确区域

通常，方法1和方法2结合使用。 一般情况下，测序结果的头尾峰非常杂乱，序列不准确。 在序列比对过程中，我们通常需要将测序结果的首尾序列片段切掉，然后再进行分析。 在进行PCR测序时，需要流出足够多的侧翼序列，使PCR片段设计得比实际需要测序的片段大，从而保证能够得到足够完整的基因序列。 如果将PCR产物克隆到载体中，可以根据载体上的通用质粒序列来保证后面不准确的区域都是载体序列。 插入序列时，已经是整齐的峰图，不会影响测序结果。

我们一般用打开SEQ文件，可以看到测序结果并进行进一步的编辑操作。

我们根据电泳图结果删除SEQ文件中第一个和最后一个不稳定片段，并保存编辑后的文件（截去开头和结尾，根据电泳图的均匀性选择截断序列）

使用名称保存文件。

将其保存在容易找到的位置。

对测序结果进行处理后dnastar序列比对，使用软件与具有代表性的外源菌株进行核苷酸相似性比较。

将代表病毒株和测序结果的SEQ文件拖入软件中，上下拖拽调整序列顺序。

选择“Align”>“ByW”（W比较时间更长更准确）； 如果想看多肽序列的同源性，可以先把核酸序列翻译成蛋白质，然后比较，前提是核酸序列是正确的 3个核苷酸的3个核苷酸排列成3个核苷酸，以密码子的第一位，否则会引起移码，导致翻译困难或提前终止。

软件开始逐条手动比较，序列的长度、数量和笔记本配置将决定需要多长时间才能完成。

比对完成后，选择“查看”>“”显示序列间的同源性。

对比结果如下，以PRRSV的ORF5测序为例。

比对之后，做一个表统计相关度。

通过PRRSV测序结果与参考菌株序列对比，可以大致看出菌株的来源。 通常，PRRSV测序选择的参考毒株应包括北美原型毒株VR-2332、国外经典毒株CH1-a、HP-PRRSV毒株JXA1（HuN4也可以）、HP-PRRSV衍生的-R (P80)、（或类似）菌株和新流行的 QYYZ 和 GM2。 对于亚洲型LV，如果它与欧洲型菌株的关系很低，则进行比较。

--谢谢，打赏和呼唤是前进的动力--

如有侵权请联系删除！