1.1 基因过表达简介

生物学研究中的传统遗传策略，往往以特定性状的变异作为起点进行探索。借助先进的高通量测序手段，研究人员可以迅速查明目标性状下基因、蛋白质及离子等物质的含量状况，进而判断某个基因在该性状形成中的作用。

实验/论文汇报时提及的基因改造方法通常包括：基因的超量合成，也称作基因的植入；基因的抑制；基因的删除。

今天就主要聊聊过表达如何实现以及设计注意点：

2.过表达的常见途径

3.过表达引物设计实操

2.1 确定过表达质粒

我们选用广泛应用的过表达载体pEGFP-N1。

质粒图谱解读：

MCS通常被称为多克隆位点，它是目的基因序列插入的部位，该位置存在的酶切点可以供实验者加入至目标基因片段，这一点必须明确无误

EGFP通常被称为绿色荧光蛋白，这种蛋白在细胞内表达时，能产生绿色荧光信号，利用显微镜可以检测到这种发光现象，从而判断目标基因是否成功导入到目标细胞中

SV40 Poly（A）通常被称为猴空泡病毒的PolyA，也就是病毒40 Ploy A，或者简称为Poly A，它的功能主要有两项，其一dnastar lasergene，负责结束基因转录过程，其二，给转录产生的mRNA分子加上Poly A尾巴，这个尾巴是由大约240个碱基对组成的DNA序列。mRNA上的Poly A片段对于真核生命体基因的稳定起着重要作用，而在原核生命体中则能加速mRNA的分解过程。

f1 ori属于f1噬菌体的复制起点，能够调控ssDNA的复制过程，该ssDNA指的是单链脱氧核糖核酸。

ori是质粒在大肠杆菌里的复制起始位点，它能让质粒序列上的DNA以滚环方式复制，从而确保质粒在大肠杆菌中能够自我复制，这也是选择转化感受态大肠杆菌的重要标准。

（6）AMP ，即氨苄青霉素，带有基因型标记 AMP r，其启动子结构能促使大肠杆菌这类原核生物分解 β－内酰胺环，从而消除氨苄带来的危害，这种抗生素在转化涂板过程中必不可少，其重要性体现在若不添加，培养皿会完全被细菌覆盖，而添加不当则可能导致无菌落生长。

氨基糖苷磷酸转移酶 NeoR/（KanR）能够灭活 G418（长那霉素衍生物），通常单一抗性基因存在于原核克隆载体与原核表达载体中，而多种抗性基因则常见于穿梭质粒，NeoR所代表的是真核抗性，它在此处作为筛选真核表达阳性细胞的标记。

HSV TK Poly (A) 含有终止子信号，该信号用于终止mRNA的转录过程，Poly A结构能够稳定mRNA分子，延长其存在时间。

生物科技持续进步，各类质粒应运而生，其内涵与作用日益繁复，核心效用却始终不变。因此，当获得一个质粒时，必须彻底探究其相关资料，然而人的记忆毕竟存在局限，关于质粒需掌握的内容大致包括：

MCS区域里有两个位置，需要填入特定的序列，这两个位置，

需要获得针对原核微生物的耐受性，通常包括对氨苄青霉素的抗性以及对卡那霉素的抗性，这些是常见的例子。

3，导入到真核细胞中可能出现的表型（例如绿色荧光等）；

挑选出对阳性细胞起作用的药物，比如常用的有G418, 嘌呤霉素之类的。

2.2 获取目的基因序列（以human TCF4 为例）

在NCBI数据库里，查找人类TCF4基因，检索顺序不做要求

(b）找到需要的TCF4并单击；

cDNA含量依据目标基因在各个组织中的体现水平进行调节，针对特定研究样本，可适当提升cDNA量，以实现高效扩增，若表达水平不高，则需相应增加mRNA的量

剪切体信息能够进行浏览dnastar lasergene，其中human TCF4当前具备46种剪切形式，依据具体条件，挑选合适的剪切体开展研究工作，比如考虑课题要求、长度因素以及研究深度等，本例选取首个剪切体，点击编号点.2

（e）在中定位CDS（ ）（单击CDS即可）；

（g）保存基因序列

1，保存序列

把TCF4 CDS序列和mRNA序列分别复制，然后粘贴到txt文档里，复制时序列前面的数字有没有都行；

把后缀名为.txt的文件改成.seq格式，更改完之后，这个文件会变成可以打开的样子，需要借助文末提到的软件才能查看。

比较CDS与mRNA的相对位置，启动相关软件，注意其安装完成后会在开始菜单中显示特定名称；

请注意，起始碱基和终止碱基的位置必须准确无误，这样才能确保在克隆环节中能够得到一条完整的TCG4的CDS区，否则无法得到有效的序列，更不用说后续将其翻译成蛋白质了

2.3 利用oligo 7设计引物（参考）

新建一个oligo 7文件，然后选择文件，新建，接着完成粘贴mRNA序列的操作，最后点击确认按钮即可

（b）上游引物设计

（定位51号碱基位置）

（定义为上游引物： ）

上游引物检测：探针二聚体情况，探针折叠形态，存在错配位点

这个数值小于三，所以根据分析的情况，它不满足条件，需要把引物序列往前面调整

起始点调整至信使核糖核酸第六个碱基处，同时将探针的尺寸（-oligo）调整为十八个碱基对。

（/ G / ≤ 3，符合要求）

理想状态下希望不存在，不过现实条件难以实现，开启卡合结构的温度需低于Tm值，此条件需满足，假的位点：XXX（高于该值）越少越好，但这个数值作用不大，可为几十或几百（位于起始行）

第二行往后评分必须低于100分，当然，设计难度特别大的引物可以适当提高一些，但最高不能超过150分

记下上游引物温度是62.9度，通常上下游引物温度的差异不会达到3度

（b）下游引物设计

（定位下游引物的5’端始于CDS的最后一个碱基）

右边的图标，确认下游温度58.2度，和上游62.9度，二者相差大于三度，需要把下游引物适当加长，也就是调整（-oligo）部分

引物下游部分长度调整为20个核苷酸，其熔解温度为61.6度，满足上下游引物熔解温度差值规定，需要特别留意，延伸操作是在引物尾端增加碱基，因此总共添加了两个核苷酸，为确保引物正确结合，必须将序列的5’端向左移动两个位置，以便下游引物能够从5’端起始位置开始配对

同样进行引物二聚体检测，发卡结构分析，错配位点分析，均符合标准要求。

（ ：符合要求）

该网站不达标，因为XXX（高于）达标；第二行的137超出100，不达标，不过137接近150，或许可用作备选，但需选用更佳方案，并考虑如何调整下游引物位置进行设计

调整下游引物位置，通常只需移动1至4个碱基，避免出现连续4-5个碱基或大量GC区域，确保其5’端从736开始

接着考察了引物二聚体情形，审视了发卡构造形态，辨识了错配位点状况，这些内容就不再深入探讨了，考察结果显示下游引物达到了标准规范。

3.近期基因编辑活动

晶锐生物具备完善的基因编辑制作流程，包括质粒，慢病毒，慢病毒制备试剂，稳定系，以及CART慢病毒；AAV病毒构建方面也具备显著长处：

4.企业介绍

广州晶锐生物科技有限公司总部位于广州市，其研发中心设立在科学城区域，在北京和上海两地设有实验设施，并与国内数十所高等院校建立了合作关系，技术团队由五名博士后、七名博士和十二名硕士组成

晶锐生物具备多年的基因改造技艺，在国内成功研发了众多IPSC基因编辑剔除系；公司拥有一支技术精湛的学术队伍；并且郑重保证，所有细胞系若未能成功构建则无需支付费用；同时每周都会举办基因改造实践教学课程，堪称当之无愧的“粤港澳基因改造领航者”！

除此之外，公司具备深厚的基因分析实践经验，致力于持续强化自身创新水平，构建更优的基因作用探索体系，协助科研人员确定理想的药物作用靶标，进而为众多科研人员提供更优质的服务，合力促进我国生命科学和医药领域的创新发展。如有合作意向，可通过后台留言沟通，或添加科研联络员微信获取项目详细信息（联络员微信号：）。公司的基因测序服务能力展示于下图。

近期精彩文章：

晶锐生物运用单细胞测序技术，深入解析CAR-T细胞治疗的分子机理，为该领域提供有力支持。

2022年10月：作为合作者，通过CD70-CD27通路，研究了PD-L1与CAR T细胞的相互作用机制。

文献链接：

https://.ncbi.nlm.nih.gov//

《关于》新冠病毒，重医附二院段晨阳-黄河教授团队，发现了其破坏线粒体质量的途径，这个途径，能够帮助病毒，实现免疫逃逸，这一机制，被该团队揭示出来

二零二二年七月：新冠病毒, 由, 肺部及血液研究所, 发现, 并, 确诊, 为, 新型冠状病毒肺炎。

文献链接：

前沿，二零二二年七月一日；十三：点，电子出版号：十点三六八九，fimmu点二零二二，点，点，点

3：交互式生信分析平台

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