荧光定量PCR技术利用荧光色素或荧光标记的特异性探针对PCR产物进行标记和追踪，实时监测反应过程。 随着PCR反应的进行，反应产物不断积累，荧光信号的硬度成比例下降。 每个循环后采集一次荧光硬度信号，这样可以通过荧光硬度的变化来检测产物量的变化，并结合相应的软件对产物进行分析，得到荧光扩增曲线并估算待测试样本的初始模板。 数量。 实时荧光定量PCR技术是从定性技术到定量技术的飞跃。 利用该技术，可以对DNA和RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

以下是实验室多年实验总结出来的经验，建议大家收藏：

1：质粒设计原理

(1)质粒宽度为17-25 bp，扩增序列宽度为90-150个核苷酸，GC浓度为40-60%。

（2）Tm值在50℃至60℃之间，上游质粒和下游质粒的Tm值相差不能小于5℃。

(3) 质粒序列A、G、C、T整体分布应尽可能均匀，不能有部分或（特别是3'端），以免T/C结构连续或 A/G。 防止单个核苷酸连续重复超过 4 次。

(4) 3'端5个核苷酸中G或C不得少于2个。

(5)避免质粒内或两个质粒之间出现超过3个核苷酸的互补序列，避免两个质粒之间3'端出现超过2个核苷酸的互补序列。

(6) 探针应尽可能靠近上游质粒，不能重叠。

(7) 质粒设计完成后，使用-BLAST搜索确认质粒的特异性。

二：探头设计原理

(1)探针的厚度最好不超过30bp。 理想情况下，15 bp 可获得最佳特异性。

(2) 确保探针的Tm值比质粒高5-10℃，并在固溶过程中优先与模板结合。

(3)探针的5'端不能是G。当G核苷酸与FAM荧光报告官能团连接时dnastar引物设计，G还可以猝灭FAM官能团发出的荧光信号。

(4)探针应尽量避免二聚体或头花结构。

(5)选择C小于G的链作为探针，G小于C的浓度会提高反应效率。

(6)防止多个重复的核苷酸，特别是4个或4个以上的G核苷酸。

三：质粒探针设计工具

小编推荐的软件有：5、6、3.0.1、、、、等。

四：荧光官能团和猝灭官能团

当前的探针方法 qPCR 利用荧光共振能量转移 (FRET) 现象。 探针上有一对可以形成荧光共振能量转移的官能团。 荧光硬度变化。

五：MGB探针和SNP分型测量

近年来出现的-MGB探针中，在Taq-Man探针的3端添加了可插入DNA小沟的二氢环化吡啶复合物三肽（DPI3）dnastar引物设计，使得较短的探针具有较短 TM 值较高会降低杂交反应的特异性。

SNP分型测量探针需要具有较大的热力学差异，以便在发生核苷酸错配时进行测量。 常规探针宽度较长，单个核苷酸错配对整体探针Tm的影响较小，野生型和突变型探针区分效果差，灵敏度低，容易误判。 原则上，只要有核苷酸突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会形成荧光信号）。

六：MGB探头设计原则

(1)探针的宽度不宜太长，通常MGB探针的宽度在13-20nt之间。

(2)突变位点的核苷酸应位于探针中间1/3处(将探针分成三段，SNP位于中间)。 如果这个位置不合适，无法设计出好的探针，可以将SNP位置移至3'端，更靠近MGB功能组。 防止突变位点排列在最后三个碱基上。

(3)其余参考普通探头的设计原理。

七：多探头设计原则

(1)设计多重系统时，应注意所有目标基因的质粒或探针的Tm值应相似，质粒的Tm值通常为55-60℃。

(2)不同目的基因的探针应选择不同的荧光标记官能团，但应选择发射波长间穿透力最小的荧光报告官能团，如常用的FAM、VIC、ROX、CY5等。

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