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自20世纪90年代探针诞生以来，尽管荧光探针（质粒）新技术不断涌现，而作为经典的定量PCR技术，探针技术始终是众多实验研究者进行定量测量的首选。 主要原因是与SYBR荧光色素相比，探针具有序列特异性，仅与互补区域结合dnastar引物设计，但荧光信号与扩增的拷贝数一一对应，因此特异性强，灵敏度高高，但条件优化容易； 与杂交探针相比，该探针只需设计一根探针，因此探针设计更加经济、方便，也可以完成基本的定量PCR要求。 事实上，定量技术也给实验操作带来了挑战，因为探针仍然需要合成。

通常，定量PCR实验的流程为：目的基因搜索与比对→探针与质粒设计→探针与质粒合成→配置反应体系→反应参数→重复实验、优化条件→获取曲线数据、比对标准曲线→重复验证。

第一步：目标基因搜索和比对流程的第一步，可以利用NCBI序列等软件完成目标DNA或RNA的搜索和比对——这相信很多人在分析基因时都会这样做测序报告。 第一步要注意的是确保分析的序列在a（，即染色体某些区域中相邻DNA片段的重叠）内。

第二步：如果其他条件相同，那么这第二步——引物和探针的设计可以说是定量PCR成败的关键。 通过总结各方面经验，有以下基本原则：

一般原则

*先选择探针，然后设计尽可能靠近探针的质粒。

*所选序列应具有高度特异性，尽量选择二级结构最小的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，并会阻碍酶的扩增。 建议先检查二级结构。 如果二次结构无法阻止，则应相应提高固溶温度。

*扩增厚度不要超过400bp，最好在100-150bp内，扩增片段越短，越容易获得有效的扩增反应。 较短的扩增子也往往能确保一致的分析。

*GC浓度保持在20%~80%之间，含有GC的区域容易发生非特异性反应，导致荧光颜料分析中扩增效率下降，出现非特异性信号。

*为了保证效率和重复性，应防止重复的碱基序列，特别是G（不能有4个连续的G）

*质粒和探针相互配对检查以防止二​​聚体和发夹。

质粒设计原理

*序列选择应在基因的保守片段中

*防止质粒本身或与质粒之间连续4次或以上配对，并防止质粒本身产生环状发夹结构

*典型的质粒长度为 18 至 24 个核苷酸。 质粒需要足够长以维持序列奇点并增加序列存在于非感兴趣序列位点的可能性。 而厚度小于24个核苷酸的质粒并不意味着特异性更高。 较长的序列可能与错配的序列杂交，从而增加特异性，但杂交速度比短序列慢，从而增加产量。

*55-65°C 时的 Tm 值（由于 60°C 时核酸外切酶活性最高），GC 浓度为 40%-60%

*质粒之间的TM差异可防止温度超过2°C

*质粒的3'端阻止使用核苷酸A，质粒的3'端阻止3个或更多连续的相同核苷酸

*为了防止扩增，质粒设计最好跨越两个外显子。

*探针技术要求片段宽度为50bp-150bp

*质粒末端（最后5个碱基）不能有超过2个G和C。

探头设计原理

*探针的位置尽可能靠近上游质粒

*探针宽度应为15-45bp（最好是20-30bp）以确保结合特异性

* 检查探针的DNA折叠和二级结构

*Tm值为65-70℃，一般比质粒TM值高5-10℃（至少5℃），GC浓度为40%-70%

*探针的5'端应防止使用G - 因为5'G会有猝灭作用，但即使被裂解也会有猝灭作用。

*整个探针中，核苷酸C的浓度应明显低于G的浓度——高浓度的G会提高反应效率，此时应选择另一条配对链作为探针。

*为了保证质粒探针的特异性，最好在blast中检查一次设计的序列。 如果发现非特异性互补区，建议重新设计质粒探针。

MGB 探头设计

*探针的 5' 端可防止 G 出现。 尽管探针被酯化为单个核苷酸，但附着在报告官能团上的G核苷酸仍然可以猝灭该官能团的荧光信号。

*Tm值应为65-67°C。

*MGB探针应尽可能短，但探针的厚度不应超过13bp。

*尽量避免重复的核苷酸，特别是G核苷酸，防止4个或更多的G重复。

*原则上，只要MGB探针中存在核苷酸突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会形成荧光信号）。 因此，在进行SNP检查时，为了测量突变体dnastar引物设计，即MGB不与目标片段杂交，不形成荧光信号，而探针的目标片段形成荧光信号测量，探头尽量放置在中间1/3的地方。

注意：

为了满足上述要求的四个条件，探针的突变位点可以连接到3'端，但突变位点在3'端前面至少2个核苷酸（即必须是确保探针核苷酸的最后两个核绝对保守）用于SNP检查。 反之，如果要进行类似的检查，则应找到保守的片段区域，并且探针中不应有突变位点。 如果探针只有13 bp，则探针仍然不完全保守。 突变有好几个，突变位点也应该靠近探针的5'端，这样即使是突变，探针也能与目标片段杂交，形成荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使是突变也能实现突变的检测。

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