先前曾提及利用NBBI网络平台进行引物构建的途径，今日整合网络信息与个人实践，系统阐述了以.0策略设计PCR引物须遵循的核心准则，同时披露了引物构建的具体流程与相关资源，期望能为从事实验研究的人员提供有益参考。

一、PCR引物设计原则

1、引物长度一般在15-30bp。

引物长度通常介于十五到三十个碱基对之间，较为普遍的是十八到二十七个碱基对，不过不能超过三十八个碱基对，原因是长度太长会使它的延伸温度超过七十四摄氏度，这样就不适合Taq DNA聚合酶进行反应了

2、引物GC含量一般为40%-60%。

引物中GC碱基的占比通常在40%到60%之间，其中45%到55%是最理想的数值，过高或过低的GC比例都会对反应的启动产生阻碍作用。同时，上引物和下引物所含GC碱基的比例以及它们的熔解温度值，必须确保彼此之间高度接近。

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。

最佳复性条件需要Tm值在72℃附近,这个范围至少涵盖55℃到80℃之间,Tm值的推算有多种途径,例如可以通过公式Tm等于4乘以G和C之和再加上2乘以A和T之和来估算,在Oligo软件里采用的是邻近配对法进行计算

4、引物3’端的碱基一般不用A。

引物尾端通常不选A, 由于A在产生错误位置时, 其引发作用比其他碱基更强些。

引物三号端若存在三个连续的相同核苷酸,例如GGG或CCC,将导致错误产生的可能性上升。

引物三端部位若存在配对情况,或形成二分子聚集,又或者构成环状构造,都可能造成PCR实验无法正常进行。

若需延伸基因序列，引物最末端的碱基不应落在密码子序列的第三个碱基上，因为该位置常出现简并现象，进而干扰扩增的专一性与成效。

8、引物5’端可以修饰。

引物5’端序列对PCR反应的干扰程度不高，所以人们经常选择它来加入修饰基团或者标记成分。

碱基必须随机散布，同时引物自身以及引物相互之间都不允许有四个连续的碱基能够互相配对。

引物序列在模板上不应有高度匹配，特别是3’端不能与模板序列过于接近，否则容易造成错误引发。为了减少引物和模板之间的相似度，最好让引物中四种碱基的分布是随机的，避免出现连续的嘌呤或嘧啶。同时，引物自身不能含有能够相互配对的序列，否则引物会自我结合形成发夹结构，导致引物自身发生复性。这种二级结构会受空间阻碍作用，干扰引物同模板的配对结合。单个引物内部不允许出现连续四个碱基的配对。两个引物之间也不得存在配对区域，特别是要防止3'端发生配对重叠，以免产生引物二聚体（包括二聚体和交联二聚体）。引物相互之间同样不能形成连续四个碱基的配对。引物二聚体和发夹结构若无法避免，则应尽可能降低其G值，确保不超过4.5kcal/mol。否则，容易引发引物二聚体的形成，同时会减少引物的有效浓度，最终影响PCR反应的正常开展。

引物的ΔG值理想状态下呈现波浪形变化，具体表现为3’端的ΔG值比较小，同时5’端和内部区域的ΔG值则显著偏大。

自由能变化值ΔG能够体现引物同模板相互作用的紧密程度，通常情况下，引物的自由能变化值分布最为理想时，其3'端数值较小，而5'端和内部区域的数值则相对偏大，3'端的自由能变化值应当比较低，并且其绝对值需控制在9以内，若引物3'端的自由能变化值过高，则容易在存在错配的位置上形成双链分子，进而触发DNA的合成过程。

引物需在核酸稳定区域内构思，且具备专一性。引物与非专一扩增片段的相似度不可超越七成，或者不可以有八个连续的配对碱基相同。

二、Real Time PCR引物设计原则

实时荧光定量PCR的引物设计规范，与常规PCR的引物设计规范有所区别。PCR技术旨在使目标基因按照预期数值进行扩增，因此，对于非特异性反应和引物二聚体的抑制要求十分严格。

Real Time PCR引物设计原则

扩增片段大小

80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)

长度

17-25 base

GC含量

40-60%(最好45-55%)

Tm值

两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值

序列

碱基分布要均衡，某些区域不能过于集中，比如GC含量过高或AT含量过高，尤其要注意3’端的这种情况，同时还要防止T和C，A和G连续出现

3'末端序列

3’末端避免GC rich或AT rich

3’末端碱基最好为G 或C

3’末端碱基尽量避免为T

互补性

引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列

引物3’末端避免2 base以上的互补序列

特异性

使用BLAST检索，确认引物特异性

RT-PCR用引物

尽量在Exon 上设计引物，限制基因组DNA扩增

三、常用的引物设计软件

那个东西，还有Oligo，以及NTI Suit，另外还有Omiga，同样也包括空白的。

下面详细介绍一下  5.0的用法

1、通过File下的New或Open载入需要设计引物的序列

2、进入到程序的引物设计窗口

3、点击，则出现新的界面

在新的页面里配置你想要设计的引物的各项参数。需要设置的共有五个部分。第一个部分是确定引物类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针，如果目的是进行PCR反应，就选择标有"PCR"的圆形按钮。第二个部分是选择搜索模式，通常情况下搜索引物都是成对进行的，因此一般选择"pairs"模式。第三个位置涉及正负链的范围区间，以及产物尺寸的长度，需要根据个人需求调整，与实验目标相关，具体问题具体研究。第四个位置关乎引物尺度，以及正负变化的数值，通常引物尺度介于18至27之间。第五个位置决定选用模式dnastar引物设计，一般采用默认选项。完成上述所有设置，点击“确定”按钮，即可进入下一操作界面。

4、点击“OK”，出现如下新界面

评估分数是衡量引物优劣的综合性指标，依据此分数可以对引物实施有效判断，并据此在引物之间进行合理挑选提供可靠依据。倘若仅需检索正向或反向引物，便可通过点击“Sense”或“Anti-sense”选项来达成目标。

5、点击评分高的结果，就可以显示引物的详细信息，如下图。

该图左上角的两个按钮

它们分别对应正向与反向引物，图中中部呈现了引物的评分，位置，长度，Tm值，GC比例，自由能等数据，图下方区域展示了正反引物是否产生发夹构造，二聚体，错配以及引物间的二聚体状况，红色标记表示存在，请点选

能够明确这些构造的详细状况，例如起始点，以及其释放的能量值。

倘若对搜寻到的引物不够满意，便能够手动修正引物的方位，并且能够点选

那个按键用来调整引物内容。参照图示，能够增添，移除，或是更改构成单位。持续操作，直至获得理想状态。

7、最后将设计好的引物导出或复制出来。

四、推荐几款在线引物设计网站

1、  

http://.ut.ee//

一个广泛使用的PCR引物设计程序。

2、-BLAST

这个网站提供了基因序列的比对工具，可以用来查找相似的DNA或蛋白质序列，用户能够输入自己的查询序列，系统会自动与数据库中的序列进行比对，找出最接近的匹配结果，整个过程非常便捷高效，适合科研人员使用。

用于聚合酶链反应的特异性寡核苷酸引物可以通过在线系统进行设计,该系统还具备与NCBI的Blast功能相结合的特点。

3、

http://..uni-.de//

提供一个在线的简并引物设计工具，基础是同源基因。

4、

http://www..nl/cgi-bin//.cgi

5、

http://.enzim.hu/?m=

重点介绍一种引物，它专门为扩增经过亚硫酸氢盐处理的序列中高度重复的部分而设计。这种引物能够配合快速等温扩增技术使用，从而有效防止非特异性扩增产物的出现。

6、Web

https://www..org/cgi-bin/web-

斯坦福大学提供的在线引物设计软件,酵母基因组数据库提供。

7、

http://www..de/

快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件。

下面就-BLAST的用法做一下介绍

进入NCBI的-BLAST，

1、-BLAST的输入

该系统具备一系列操作特性。输入部分由三个主要区块构成：首个区域为参照样本展示区，第二个区域用于输入识别序列，第三个区域负责检测匹配的精确度。

参照图像，在“PCR”左侧的文本区域填入FASTA格式的序列，或者，或者通过“选择文件”按钮导入FASTA格式的文档。右侧区域用于设定正向引物和反向引物的起始点及结束点。在“ ”部分，能够填写PCR生成片段的尺寸和Tm值数据。倘若引物已经设计完成，需要检测引物的性能优劣，可在此处录入信息。

2、验证引物的特异性

在“配对”部分，需要确定设计或验证引物时的目标数据资源及所属物种。这一环节十分关键。系统内置了七种数据资源：mRNA库、s库、nr库、()库、( )库、库，以及全部来源的库。建议选用“ ”数据库； ( from all )属于NCBI染色体数据库的早期版本，现已不再推荐；用户亦可采用个人序列构建的数据库进行检索。若以NCBI提供的参考序列为基准，并以此作为参照数据库

依据规范来构思引物，-BLAST能够制定出专门针对某个特定拼接变异体基因的专属引物，该引物具有高度选择性。和其它BLAST工具相似，在页面下方点击相应按钮，可以进入更丰富的参数调整界面。

3、结果界面

这幅图展示了引物的图像化呈现，能够标明每条引物的起始点和终止点，同时还能标示出基因的CDS区域以及外显子的具体位置。

此外，-BLAST还会提供每个引物对的详细资料，如图所示。这些资料涵盖引物序列，其长度dnastar引物设计，起始和终止位置，Tm值，GC含量，自身配对以及3'端配对状况，还有PCR产物的大小和位置等。在这些信息中，Self和Self 3'的数值应当尽可能小。

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