1 背景知识介绍

1.1 什么是基因突变

突变，因基因，其为遗传物质，于复制时，或在细胞分裂进程里，会出现DNA，或RNA核苷酸，还有基因，以及染色体的轻微改变，此即基因突变，突变为随机发生，且未修复，其对进化而言，有可能是有益的，也有可能是有害的。

1.2 基因突变和突变功能的改变

从遗传物质角度看，突变随时都可能以任意形式出现在这些遗传物质的任何一处地方，通常意义上，基因能够在一定程度上被简单地理解成DNA该种物质，将着眼点放在某个基因上，基因又能够被进一步简单地划分进而归类属于两部区域，它们分别是调控区以及编码区，这里针对的则是讲解部分里提及到的编码区点突变，调控区在基因调控功能方面所起的作用是，在生物个体发育的整个时段演变过程里的合理且恰当的时间节点上，启动或者关闭基因转录的进程，甚至还能够起到对基因转录进行抑制的作用，编码区的独特效能在于，它所携带的是那些具备功能特性的较为复杂的功能性分子结构的得以形成的遗传密码，一般而言这些功能性分子结构所指的通常就是蛋白质这种物质，蛋白质这种物质往往是由数量很多甚至达到数百个的氨基酸共同组合连接起来而最终形成的链状物，细胞能够产生种类数量大概为20种的常见标准氨基酸，恰恰是这些氨基酸所具备的各自独有的数量以及排列顺序，赋予了蛋白质这种物质特定性质的功能。每个氨基酸都由DNA中，四个可能碱基对里的三个，独特序列或密码子编码，这三个碱基对是A-T、T-A、G-C和C-G，A-T、T-A、G-C和C-G指的是四个含氮碱基，分别为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。所以，改变DNA序列的突变，能够改变氨基酸序列，进而可能降低或灭活蛋白质的功能。基因调控区域的DNA序列出现变化，会对基因蛋白质的时间以及可用性产生不利影响，而且会导致严重的细胞功能障碍。另一方面，许多突变呈沉默状态，其在功能层面未体现出明显效果，部分沉默突变存于基因间的DNA里，又或者它们归属于不会致使显著氨基酸改变的类型。

1.3 基因常见突变类型

基因发生突变是较为经常出现的情形 ，这并没有什么值得惊诧的地方 ，原因在于人体之中存有着数十亿数量众多的细胞 ，这些细胞始终持续不断在进行分裂 ，其目的是用以替换掉那些老旧的出现衰竭状况的细胞 。在绝大多数的状况之下 ，DNA开展复制或者分离过程里所产生的错误 ，会被酶以很快的速度进行修复 ，或者是在这些错误造成持久性毁坏之前 ，就会把细胞予以摧毁 。当成功躲避过生物体自身所具备的修复机制之后 ，基因方面的突变得以发生 ，而突变所呈现的类型主要包含有以下的几种 ：

互变异构：其发生于细胞核DNA进行复制的进程里，互变异构体属于不匹配的核苷酸碱基对、

（2）脱嘌呤（）：这种化学反应会发生dnastar引物设计，当DNA中的脱氧核糖与鸟嘌呤之间的键断裂时是的，当DNA中的脱氧核糖和腺嘌呤的嘌呤碱基之间的键断裂时也是的。而失去嘌呤碱基，是一种常见的自发突变。

（3）脱氨作用（）：此情况会发生，前提是酶从氨基酸里将一个氮基团去除 。

（4）转置，和，颠换：上述这些突变，属于两种类型的DNA替换错误，此错误涉及核苷酸碱基对的转换。

1.4 基因点突变类型

核苷酸数量发生变化，或者其类型出现变化，此被称作点突变，而点突变的影响范围涵盖从无害一直到威胁生命的情况。当核苷酸碱基存在错配现象，或者出现重排序的变化，并且这种变化不会对细胞功能产生影响时，就被认定为沉默突变。能够有新的氨基酸出现，且这个新的氨基酸甚至有可能发挥出犹如它所取代的氨基酸那样的相同功能。当前，点突变是诸多前沿研究的热点，举例来说，大规模测序，寻找到易感基因，接着依据易感基因再去找到易感位点；蛋白会存在修饰，诸如磷酸化、棕榈酰化、瓜氨酸化等等；这些数据的获取或者后续的验证，都是常规实验很难达成的。那么基因的点突变主要包含一下几种类型：

（1）错义突变（ ）：这种情况会在编码区一个核苷酸被另一个取代时发生，会导致多肽产物的氨基酸序列改变，这种碱基的取代能够干扰正常的蛋白质合成与功能。

需要注意的是，你提供的内容括号部分缺失具体内容，我先按完整的句子结构为你改写：（2）存在这样一种情况，被称作无义突变，它是编码区核苷酸出现的突变，进而产生了一个过早的终止密码子，或者产生了一个不编码任何氨基酸的密码子，而这种突变会对蛋白质的正常功能造成影响。 .

（3）移码突变（ ）：于再编码区发生那个突变过程之时，所插入或者删除的核苷酸数量并非三的倍数（要知道三个碱基才构成一个密码子），如此一来便改变了在突变下游的基因部分的读取框架，进而致使其编码出完全不一样的蛋白质序列 。

（4）同义突变（ ）：存在于DNA片段中的情况，有时会出现某个碱基对发生突变，然而这种突变并不会使所编码的氨基酸出现改变，其原因在于处于该位置的密码子，在突变之前与突变之后均属于简并密码子。

还有突变的别的类型，像拷贝数变异，还有染色体突变等这一些，那些是更为复杂的、范围更大的突变，常常跟疾病有关联，不过从进化的角度来讲，到底是好还是坏，还得在时间方面进行考量，在这儿就不再详细叙述了。

构建2点突变载体，此突变以人类TNF-α第100位G氨基酸会发生改变作为例子。

2.1 首先在NCBI下载人类TNF-α序列

（1）查询人类TNF-α基因

查询基因，开始定位，直接进入NCBI，选择数据库为“Gene”，在复选框中输入“TNF-α human”，点击后得到数据库收集的相关数据，这些数据如标注的图1和图2所示，图中选择的是人类的TNF-α基因 :

（图1 检索人类人类TNF-α基因）

图2，检索出人类TNF - α基因，点击之后进入，借此获得基因以及氨基酸序列。

查询基因mRNA，进行定位，依据所提供的有关TNF-α human的信息，找寻mRNA，点击“.4”，从而进入到mRNA的具体信息之中 。

（图3 找到mRNA 和蛋白（）信息）

在基于上一步操作的基础之上，找出定位到的特别具体的mRNA信息（），然后于同一个页面当中去寻觅该基因的CDS区，最后点击CDS进而能够得到CDS区的碱基序列；

（图4 定位并获取CDS的碱基序列）

获取CDS碱基序列，点击图4的CDS，会转到基因编码区序列信息展示界面，整个编码区从ATG起始密码子到终止密码子TAG都有特别着色，把呈现的编码区序列保存到软件里，要是已下载，直接将序列保存到txt文件并把后缀改成“.seq” 。

（图5 有背景的碱基即为整个编码区的序列）

2.2 碱基及对应氨基酸的查询

把保存着的".seq"文件打开，此处要使用另外一个软件予以操作，将软件打开后，执行这样的操作：file-open，找到要作分析的.seq序列，个人建议直接把这个序列拷贝到输入框那儿就成；

（图1 软件打开示意图）

（图2 成功打开碱基序列示意图）

将碱基密码子转化为氨基酸时，点击图2里红色箭头所指示的、进行碱基翻译为氨基酸序列的功能按钮，才能够完成密码子到氨基酸的改变，条件是要把所有的碱基序列都选中；

图3，碱基被展示，氨基酸展示结果被选中，在被选中的这些当中，我喜欢图里的这种设置dnastar引物设计，大家也能够依据自己所喜欢的展示形式，去挑选对应的展示选框。

（图4呈现碱基与氨基酸的对应模式，红框所标记的碱基处于此模式中，红框所标记的氨基酸也处于此模式中，标记红框的碱基位置以及标记红框的氨基酸位置是本次需要进行突变的位置）

2.3 突变信息的确定

第100号氨基酸原本是-G（甘氨酸GGG），此次突变是将其突变为氨基酸-R（精氨酸CGG） ，因而突变氨基酸及碱基得以确定 ，如此一来 ，我们仅仅需要把298的碱基“G”突变为“C”就行 ，各位看官能够依据自身实验去进行相应的突变 。

将原始数据中第298为碱基G改为C：

(图1原始碱基的G改为C示意图)

2.4 突变引物的设计

关于突变引物的设计 ，我们要想通过两对引物达成基因的点突变 ，第一对引物即F1/R1（可参照本公众号推文“基因过表达（）引物（）设计 + 质粒图谱详解”） ，用于扩增整部CDS区域 。接着说第二对引物F2/R2（此对引物不遵循严格的引物设计准则 ，只需确保突变碱基被涵盖进去 ，长度大概处于18 - 30bp范围之内） ，需在点突变的位置展开设计并尽可能把突变点放于引物中部 。PCR扩增进程涵盖四步 ：第一步 ，F1 - R1扩增获取TNF - α基因 ；第二步是F1 - R2 ；第三步为F2 - R1 ；第四步 ，把第二三步的PCR产物当作模板 ，用F1 - R1扩增得到整部突变后的序列 。

（图1 双引物PCR扩增突变基因序列示意图）

3 结束。

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