具有良好特性的引物能够使得PCR实验达成所期许成果的一半程度，所以，引物的设计始终都是PCR流程里极为关键要素。相较之下，这两款软件想来必然是深受科研工作者们所赞许且推举应用的引物设计类软件。然而对于处于懒癌晚期阶段的小鱼来讲，去下载获取这两款软件同样是一件极为繁杂困难的事情。是否存在比这两款软件更为简便直接的引物获取方式呢？在此处，小鱼特意为大家推荐三款具备简便操作性且实用的在线PCR引物设计软件，能够让你在极短时间内就完成PCR引物的设计工作。

No.1 ：NCBI的-Blast

推荐指数：五颗星

原因在于，该工具将当下流行的软件予以整合，并且增添了NCBI的Blast用以开展引物特异性的验证，能够针对某一特定的剪接变异体基因去设计引物。

网址链接：

网络地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/-blast/ ，或者是直接从那个Blast主页 ， 。

该内容是在（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）这个网址上面被找到。

Blast的界面涵盖了4个部分，其中有一个部分叫模板区，一个部分叫引物区，还有一个部分是Exon与外显子内含子设置相关的，另外一个部分是check也就是特异性验证区 。

1、设计引物

2、验证引物好坏

3、外显子内含子（Exon/）

若是所设计的引物处于跨内含子与外显子的交界处，那么能够在此处将其设置成 must span an exon-exon 。关于外显子的匹配碱基数以及内含子的长度等方面的设置，通常会选择默认状态。

4、特异性（）

在check区，选择设计引物时的目标数据库和物种，选择验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。

这里提供了7种数据库：

mRNA，来自，RNA，非，所有，和。 注意：你提供的内容本身表述较混乱，这样改写后也比较难理解其确切逻辑，仅按照要求进行了形式上的改写 。

头两个数据库乃经专家注释过的数据，如此能够给出更为精准的结果。尤其dnastar引物设计，当你将NCBI的参考序列用作模板，把带参考序列的数据库当作标准以便设计引物之时，-BLAST能够设计出仅扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。

最后给出建议，使用条件是去验证引物自身所具备的各种特性，要验证发夹结构，需要验证引物自身二聚体，要验证错配情况，还要验证引物间存在的二聚体，以及G的绝对值情况。

No.2 ： Plus

推荐指数：五颗星

原因在于，严谨的qPCR引物设计普遍需求于其之一的引物跨越外显子，最优是于3‘端进行引物设计，产物的长度处于300bp以内等等。这款在线软件能够达成qPCR引物设计的要求。

网址链接：

http://www..com/

一旦选择Run，便进入设计引物的主要页面，通过合理加以运用，［］以及｛｝这些符号致使引物设计与之相合，契合自身需求，大家能够于具体实际操作当中，深入去体会这几个符号所带来的便利之处。

要避免出现多个重复碱基，还要避免4个或多于4个G出现在引物序列里。要按照荧光定量引物的要求来设置参数，产物长度方面，不应当超过400bp，最好是100 - 150bp；GC％要在30％ - 70%，最好是45%－55%；引物长度为18 - 25bp，最好是22 - 24bp；TM值是58 - 60℃，最好是60℃；3’端要3’端至少4个碱基保守，最好是T，C，G 。

3、点击右上放绿色按钮

，能够取得若干对引物哦，并依照5’到3’这般的顺序呢 ，其涵盖着 （即引物）以及产物的一些基本参数 ，是可以依据荧光定量引物的要求呀 ，尽力挑选以G、C作为结尾的引物来进行合成 ，就如同下边图里红框所展示的那样 ，并且还能够在序列图当中看到引物所处的位置 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。 ， 。

在设计好引物之后，我们需要开展NCBI blast引物验证工作，进入到相关流程之中，。

这个网址是，美国国立医学图书馆国家生物技术信息中心提供的，用于序列相似性搜索的，Blast在线工具的链接地址 。

5、于Basic BLAST里点击选项，在下方框内，按照5’－3’的顺序，分别将上游引物以及下游引物予以输入，且上下游引物之间间隔20个以上的n 。

6、挑选物种数据库，像是Human，Mouse或者（要是属于非人和非小鼠物种的话）。

7、选择 ()

8、进行点击操作，于特定位置输入1000，在Word Size也填入7。此处Word size并非字体大小之意，需明白是指读长，要将其按照7个一组的核苷酸序列放置到要求的地方进行比对 。

9、点一下BLAST，着手进行比对dnastar引物设计，进而出现结果。颜色所代表的是得分，挑选引物的原则如下：在列表里大部分属于目的基因，这表明引物的特异性是高的；然而有可能物种并不相同，这意味着该基因在不同物种当中是保守的。

No.3 ：

推荐指数：五颗星

有这样一个理由，存在着一个哈佛大学的qPCR引物数据库，当前该数据库里有着超过20万条引物，这些引物覆盖了人和小鼠大部分已知的基因。按照网站上针对两万多对引物的验证结果来看，引物的有效率是82.7%。应尽可能去选择这种经过验证的qPCR引物，如此一来qPCR的品质才比较有保障。

网址：

http://pga.mgh..edu//

搜索类型这个地方啊，能够依据 、NCBI 、NCBI gene ID 、ID 、NCBI gene 和六个选项去开展搜索。就拿小鼠的 beta - actin 作为例子来讲哈。

1、首先，前往NCBI那儿，去找出β-actin对应的gene ID，就如这图所示，要选择gene，然后输入beta-actin：

点击右边的分类：

最终结果得以呈现，其中小鼠beta - actin的NCBI gene ID为11461，并且actb属于小鼠beta - actin的NCBI gene 。

2、把11461输入到里面试试：

针对这个结果，我们能够看到beta - actin的NCBI gene ID，看得出还可看到NCBI，并且能看到DNA等信息。

若是将输入改成beta - actin的NCBI gene，也就是actb，同样能够得到相同的结果，继续往下拉，我们还能够看到经过验证的引物，。

4、点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息：

编后语：

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