具有作为可替代PCR核酸检测技术之称的重组酶聚合酶扩增（ ，RPA），这件事是由英国公司开发的，基于此的核酸扩增产品，能够在常温状态下，于15分钟内开展单分子核酸检测，该技术对于硬件设备的要求是很低的，在体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等诸多领域有着特别适合应用的特性。

酶促重组等温扩增，也就是ERA，是苏州先达基因科技有限公司独立自主开发的，该项技术拥有全球自主知识产权，它能在低温条件下，也就是25 - 42℃对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度35 - 40℃时，扩增反应时间只需15分钟，借此达成核酸快速检测的目的，该技术对硬件设备的要求同样很低，现已被应用于研究诊断、公共卫生、食品安全、水产畜牧等各个领域。

用来进行RPA和ERA扩增的引物，能够讲得上是整个反应最为关键的要点之处dnastar引物设计，那么究竟要怎么样才可以把其引物设计得很好呢？

1、RPA引物需要多长？

RPA引物大多处于32到35个核苷酸的范围之内，某些情形下会用到少于30个核苷酸的引物，不过扩增进程会明显地减缓，。

ERA 引物需要多长？

考虑到要将ERA的检测速度以及灵敏度予以充分利用，我们向客户提议使用长度为29至32个核苷酸的引物。一般情形下，PCR引物能够用于ERA反应体系，然而这类引物的检测速度与灵敏度或许比不上较长的引物。

2、RPA引物应当相距多远？

你的这种具体应用情况就是予以决定者，标准试剂盒于不超过500bp的扩增产物方面适用，RPA扩增产物大小不存在下限，然而RPA引物普遍使得扩增子超过80bp才行，扩增产物处于100 - 200bp之间时，能够达成最快的RPA扩增。

ERA 引物应当相距多远？

通常来讲，我们给出建议，两个ERA引物所获取的扩增片段，不应该超越300bp。ERA扩增片段的大小，可能不存在下限，然而依据ERA引物的最小长度，扩增片段的大小，最小大约80bp。要想得到最快的检测速度，最终的扩增片段长度，应当是100 - 200bp。

3、RPA 我需要筛选多少引物？

这得看你对于检测灵敏度所提出的要求，比如说，要是目标分子数量达到上千，那么绝大多数的引物便都能够满足使用需求了，要是对灵敏度有着非常高的要求，那么最好是去开展系统性的引物筛选工作，最初进行筛选之时，候选引物能够有10到20对，测试的引物数量越多，找到优质引物的概率也就会越大。

ERA 我需要筛选多少引物？

那是依规您针对检测灵敏度所提要求而定的。比如说，要是您仅仅只需针对每个反应去检测达到1000个分子及以上，那么多数的引物对便都能够满足使用需求了。对于具备极高灵敏度的检测而言，较为妥当的做法是开展系统性的引物筛选从而去寻觅优良的 ERA 引物。在最初进行筛选之际，所测试的引物条数通常条件下是正反向引物各自为7条。所拿来测试的引物数量越多，那寻找到能够检测单个分子的优良引物对的概率也就会越大。

荧光型ERA产品探针设计

探针的长度处于46至52个核苷酸的范围，这里面至少有30个处于THF位点的5’端，除此之外，还有至少15个处于该位点的3’端。荧光团以及淬灭团仅仅能够标记在胸腺嘧啶也就是T上，并且荧光团与淬灭团之间所隔的碱基数量在2至5个。THF是用来替换处于荧光团与淬灭团之间的某个碱基，而且dT - 荧光团或者dT - 淬灭团与THF之间的核苷酸数量能够是0、1或者2。探针的3’端需要加上阻断基团。

试纸型ERA产品探针设计

有种探针，其长度是 46 到 52 个核苷酸，这里面至少有 30 个处于 THF 位点的 5’端，并且另外至少 15 个处在该位点的 3’端。THF 呢，它要替换位于荧光团下游 30bp 后，与阻断基团上游 15bp 之间的某个碱基，而那个荧光团仅限标记在胸腺嘧啶（T）上。还有哦，探针的 3’端得加上阻断基团。

反应需要用多少引物？

每回基础反应所需求的引物量是480nM ，偶尔，略微变动一下引物的用量能够提升其性能。对不同的引物浓度展开测试，就是从200nM至600nM这个范围，这会有助于找寻到最为合适的引物浓度。

反应需要用多少探针？

每次反应一般所需探针为120nM 。然而，有时稍微变动探针浓度会促使反应得以进行。处于一定浓度范围当中（从50nM至150nM），依据自身具体应用，我们能够对探针予以优化。

现成的PCR引物能用吗？

RPA多半不行。绝大多数PCR引物不能用于RPA。

一般来说，在平常的状况下，PCR引物能够被应用于ERA反应体系之中，不过，这一类的引物，它检测的速率以及灵敏度，或许是比不上那些比较长的引物的。

现成的PCR探针能用吗？

不行。大部分经常使用的PCR探针并不适宜RPA或者ERA反应。尤其是运用了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这种酶活性根本不兼容。

筛选引物的时候必须用探针么？

不见得。能够用于评估候选引物性能的检测方法有很多。然而dnastar引物设计，就筛选高灵敏度引物而言，借助检测探针对扩增实行实时监控，已被证实为此种情形下最快且最省力的办法。

引物筛选时应该用什么样的条件？

用于引物筛选的条件，最好尽可能去模拟实际进行检测时所具备的条件，像模板的拷贝数，样本的纯度等情况 ，诸如这些方面 ！

给定引物的性能还能再提高么？

通常来讲，对引物的序列稍微做些变动能够提升其性能。任意给定的引物，能够借助这样的模式予以优化：基于单核苷酸，稍微去改变引物的长度；又或者维持引物长度不变，依据1bp来移动引物的位置。经过变动的那些引物，要重新开展扩增活性的测试。

RPA引物的熔解温度应该是多少？

常温下进行的是RPA和ERA反应，DNA的解链跟PCR有很大不同，传统估算的熔点不适用于此系统。

引物需要特别纯化么？

在开展引物筛选工作之际，通常是不需要进行纯化操作的。在别的状况之下呢，引物的质量是会致使批次之间出现差异的。要是对于一致性方面的要求相对比较严格的话，那么最好是先对引物予以纯化，之后再去进行RPA或者ERA反应，。

使用引物和探针的时候还需要注意些什么？

体系之中，引物要添加进入之时，探针也得添加进去，若引物、探针添加次序有所先后，片段进行重组就会出现偏向性，是这样的情况 。

我该如何选择探针？

如果选用适用于探针的某一种试剂盒，需留意，于标靶区域挑选探针位置之际，存在一些序列限制。倘若有不合理的限制，本公司能够协助您设计备选检测方案。

我如何配制冻干引物、探针？

常规情况下，会采用 TE（其为 10mM Tris - Hcl，pH 值为 8.0，且含有 0.1mM EDTA）用以制备处于 100μM 状态的储存溶液，并且会将其长时间储存于零下 20℃的环境之中。

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