PCR是美国科学家提出的一种快速、大规模DNA扩增的方法，在体外简化条件下模拟体内DNA复制。 这项技术荣获1993年诺贝尔化学奖。 以待扩增的DNA分子为模板，以一对与模板互补的寡核苷酸片段为引物。 在DNA聚合酶的作用下，DNA分子按照半保守复制机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA。 合成。

——卡里·B.

PCR简介

PCR反应条件

1. PCR反应组分

(1) 模板

A。 单链和双链 DNA 均可使用

b. 纯蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应

C。 浓度一般为100ng/100μL。 浓度太高会导致非特异性扩增增加​​。

d. 完整性模板的降解将导致 PCR 扩增中没有产物。

(2)引物

A。 设计适当的长度并避免二级结构和二聚体。

b. 完整性避免反复冻融

C。 浓度为0.1-1.0μmol/L。 浓度过高，容易导致模板与引物错配，反应特异性下降； 如果浓度太低，扩增产物就会太少。

(3) 水

补充系统，保持适当的pH值，避免污染

(4)反应

A。 pH、盐离子、稳定剂、增强剂 b． 提供缓冲环境

(5)镁2+

A。 浓度0.5-2.5mmol/L，DNA聚合酶激活剂。 浓度过低，Taq酶活性丧失，PCR产率下降； 浓度过高则不专一、严重。

b. 它能与负离子结合，因此反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离Mg2+的浓度。

(6)dNTP

A。 浓度一般为20-200μmol/L。 这四种类型应该是相等的。 浓度取决于扩增产物的长度。 如果浓度太高，很容易造成错误碱基的掺入。 如果浓度太低，反应收率会降低。 可与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低，影响DNA聚合酶的活性。

b. 避免反复冻融 (7) Taq DNA 聚合酶

C。 浓度为 0.5-2.5 U/50 µl。 增加酶用量会降低反应特异性； 酶量过少会影响反应收率。

2. PCR反应循环参数

（1）变性——将双链DNA熔解成单链——93-95℃，20-30秒——变性温度低，熔解不完全是PCR实验失败的主要原因

（2）退火——温度40-60℃，由引物长度和GC含量决定，一般Ta=Tm-3~5℃——提高温度可以减少引物与模板的非特异性结合； 降低温度可以提高反应的灵敏度。 -时间30-60秒

(3)延伸——温度70-75℃，通常为72℃。 温度太高不利于引物和模板结合——时间由扩增片段的长度决定，1kb内，1min就够了，延伸时间太长会造成非特异性，但对于低特异性的扩增——浓度模板需要延长时间。

(4)循环次数——主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次——次数过多：扩增效率下降，错掺率增加

PCR引物设计

A。 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。

b. 引物设计的最大原则是最大化扩增效率和特异性，同时最小化非特异性扩增。

1. 设计原则

首先，该序列应位于高度保守的区域，并且与非扩增区域没有同源序列。

(1)长度：引物长度一般为15-30 bp，通常为18-24 bp，但扩增长片段时，引物长度为30-35 bp。  引物太短很容易造成错配。 示例：12bp 引物在人类基因组上有 200 个潜在的退火位点，而 20bp 引物在人类基因组上只有 1/400 个退火位点。 较长的引物（28-35bp）也常用于区分同源性较高的模板序列或产生一些突变位点。

(2)GC含量引物序列的GC含量一般为40-60%。 过高或过低都不利于反应的引发。 上下游引物的GC含量不能相差太大。

(3) 结构  尽量避免引物序列形成发夹结构，尤其是3'端。 尽量避免引物之间形成二聚体，尤其是 3' 端的前三个碱基。 避免局部富含GC或AT，并避免3'端出现相同的连续碱基，例如富含GGG、CCC和AT。

(4) 错配  尽量避免模板上有错配位点的引物。 当无法避免不匹配时，最好不要生产产品。 特别是，3' 端不应形成非特异性结合。 引物3'端存在超过3个连续碱基，例如GGG或CCC，也会增加误触发的可能性。

2、设计软件

PCR引物设计大多通过计算机软件完成。 您可以直接将模板序列提交到特定网页以获得设计的引物，也可以在本地计算机上运行专业的引物设计软件。 引物设计需要一定的经验，不能仅仅依靠软件。

常用软件

.0（自动搜索）*

（底漆评估）

NTI套装

欧米茄

（在线服务）

.0使用介绍

1. .0 下载并安装。 -sbio.tmmu.com.cn首页下载中心

2..0使用演示

.0 使用步进：

(1) 粘贴序列：复制序列>File>New>DNA>Ctrl+V，选择AS为

2. >Sech>设置引物参数>OK

3. 搜索完成后，点击“确定”，选择符合要求的引物序列。

4. 喷砂检查引物特异性，必要时重新设计。

.0 评估入门方法

粘贴序列：复制序列>File>New>DNA>Ctrl+V，选择AS为

2.>S>编辑>Ctrl+V>>>确定

3.>A>编辑>Ctrl+V>>>确定

PCR常见问题解答

1.无扩增产物

现象：阳性对照有条带，而样品没有条带

原因：1.模板：含有抑制剂，含量低

2. 引物：错误、设计不当、降解、合成和纯化不良

3、反应条件：退火温度不合适、延伸时间太短、循环次数少

对策：1.纯化模板或使用优质试剂盒提取模板DNA，或增加模板使用量

数量

2、合成前检查，重新设计，更换管子dnastar引物设计，重新合成

3.梯度PCR，延长延伸时间，增加循环数

2. 非特异性扩增

现象：条带与预期大小不一致或条带非特异性扩增

原因：1、引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3、酶过多

4.Mg2+浓度过高

5、退火温度低

6、循环次数过多

对策：1.重新设计引物或使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3、适当减少酶的用量

4.降低镁离子浓度

5、适当提高退火温度或采用两段升温法

6.减少循环次数

3. 尾随

现象：产品在凝胶上呈现涂抹状

原因：1、模板不纯

2.不合适

3、退火温度低

4、酶过多

5、dNTP、Mg2+浓度过高

6. 循环次数已过

对策：1、净化模板

2. 更换

3、适当减少酶的用量

4.降低dNTP和镁离子浓度

5、适当提高退火温度

6.减少循环次数

4. 污染

现象：目标扩增产物出现在空白对照中

原因：目标序列或扩增产物交叉污染

对策： A. 操作轻柔，防止形成气溶胶污染； 防止目标序列被吸入样品枪

或从离心管中溅出

b. 试剂应先等分，然后低温保存。

C。 对耐高温的试剂或耗材进行高压灭菌

d. 更换实验室或试剂耗材

提高PCR特异性的方法

A。 巢式 PCR（Nest-PCR）

Ø 由于目标序列与多组引物配对，减少了扩增多个目标位点的可能性

很少。 提高对有限数量的靶序列（例如稀有 mRNA）的灵敏度。增加难度

PCR（例如 5' RACE）特异性困难

b. 递减PCR (PCR)

Ø PCR的前几个循环使用严格的退火条件以增加特异性。循环设置

从比估计 Tm 高约 5°C 的退火温度开始，然后每个循环

降低 1-2°C，直到退火温度低于 Tm 5°C。 Ø 最具体的目标

模板会优先扩增，这些产物会在后续循环中继续扩增。

根据优点，消减PCR适合那些不了解引物和目标模板之间同源程度的人。

高水平的方法比较有用，比如AFLP、DNA指纹分析等。

C。 热启动PCR（PCR

Ø 热启动主要通过抑制重要成分来延迟 DNA 合成，直到

PCR机达到变性温度； 通常选择热启动Taq酶； 热启动 PCR 是

除了良好的引物设计外，提高PCR特异性的最重要方法之一是

d. PCR增强子

Ø 甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等可作为PCR的增强剂。

Ø 可能机制：增强高GC链的熔解，降低熔解温度，有利于引物

退火有助于DNA聚合酶延伸穿过二级结构区域。增强剂的浓度应适当

什么时候。

逆转录聚合酶链反应（-PCR）

•结合RNA逆转录(RT)和cDNA聚合酶链扩增(PCR)的技术。 首先利用逆转录酶从RNA合成cDNA，然后以cDNA为模板，扩增合成目标片段。

• RT-PCR是目前从组织或细胞中获取目的基因并对已知序列的RNA进行定性和半定量分析的最有效方法。

RT

1. RT

• 逆转录( )

以RNA为模板合成互补DNA的过程。

• 逆转录酶（RNA 依赖性 DNA 聚合酶）

RNA 指导的 DNA 聚合酶活性

2. RNA水解酶活性

3. DNA引导的DNA聚合酶活性

2. RT反应组分

(1)模板组织或培养细胞RNA

(2) 引物oligo dT、随机引物、基因特异性引物

(3) 逆转录酶AMV、M-MLV、Super-、Quant

(4)RNA酶抑制剂

(5)等底物浓度的四种dNTP

(6) 反应环境缓冲液(RT)

3. RT 引物的选择

A。 随机引物：适用于长RNA或具有发夹结构的RNA，特异性最低。

20 µl 系统中的起始浓度范围为 50-250 µg。

b. Oligo(dT15-18)：适用于带PolyA尾的RNA，目标片段为

PolyA 在 2kb 以内。 20 µl 系统中的起始浓度范围为 0.2-0.5 µg。

C。 特异性引物：与靶序列互补，是反义寡核苷酸，适合靶序列。

对于已知条件，20μl 系统中的起始浓度范围为 1 pmol。

d. RT逆转录酶的选择

• AMV：禽成髓细胞瘤病毒、逆转录酶和RNase H 活性。

最佳温度为42-60℃。

•MMLV：鼠白血病病毒、逆转录酶、RNase

H活性较弱。 最佳温度为37℃或42℃。

• 超级 -：MMLV 反转

转录酶的 RNase H 突变体，可转化大部分 RNA

转入cDNA时，最适温度为42℃。

•Quant：一种新型高效逆转录酶，

对RNA模板亲和力强，对GC含量高的模板读出效果好

质量好，稳定，适宜温度37℃。

逆转录聚合酶链反应法

两步RT和PCR分别进行

同时进行一步 RT 和 PCR

• 两步法和一步法 RT-PCR 的比较

两步法 一步法

引物 Oligo dT、随机引物、GSP GSP

优点 •PCR扩增失败时易于分析原因； •特异性高、灵敏度高；

•均在最佳条件下进行，反应效率高•操作简便，污染概率低

•cDNA可长期保存

适用于 • 用于mRNA表达分析 • 适用于病毒和病原菌的检测

•检测多种靶基因•分析大量样本

•半定量RT-PCR •定性

RT-PCR 元件

分离出高质量RNA -纯度OD260/280=1.8-2.0； - 1.2甲醛变性凝胶显示明亮清晰的28S和18S条带，28S的亮度是18S的两倍以上； -分离过程中避免RNase污染使用高活性逆转录酶，提高逆转录酶的孵育温度，减少基因组DNA的污染。

RT-PCR 常见问题解答

1.无扩增产物

现象：阳性对照有条带，而样品没有条带

原因： A. RNA 降解或起始量较小

b.RNA含有抑制成分

c.cDNA 5'末端不完整

d. 目的基因在组织中不表达或表达水平过低。

对策： A. 分离高质量 RNA

b. 使用高温逆转录酶

C。 使用随机引物或 GSP

d. 尝试其他组织

2. 非特异性扩增

现象：条带与预期大小不一致或非特异性扩增

原因： A. 基因特异性引物较差

b. 模板和引物的非特异性退火

c.Mg2+浓度过高

d. RNA中存在内源或外源DNA污染

e. 引物二聚体的形成

对策： A. 重新设计引物

b. 使用基因特异性引物进行反转录，或使用 PCR

C。 降低镁离子浓度

d. 使用扩增级处理过的 RNA，并使用过滤吸头或引物组

跨内含子计数。

e. 设计 3' 端无互补序列的引物

3. 尾随

现象：产品在凝胶上呈现涂抹状

原因：a.cDNA浓度过高

b. DNA 降解时产生的寡核苷酸的非特异性扩增

C。 PCR反应中引物过多

d. 循环次数太多

e. 退火温度太低

对策： A． 减少 cDNA 的用量或增加稀释倍数

b. 提取高质量 RNA 并设计跨越内含子的引物，以防止基因组污染。

降低底漆使用效率

C。 优化PCR反应体系

d. 适当提高退火温度

RT-PCR 应用

1. 获取目的基因

2. RNA 的定性和半定量分析

实时荧光定量PCR

常规PCR是对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。 起始模板无法准确定量，扩增反应无法实时检测。 实时PCR是在PCR反应体系中添加荧光基团，利用荧光信号积累实时监测目的基因的扩增情况，通过Ct值和标准曲线的处理对起始模板进行定性定量分析。

方法介绍

非特异性荧光标记： 1. SYBR Green：

特异性荧光标记：2.：

3.：

方法一----SYBR绿色法

工作机制

• SYBR Green 可以结合双链 DNA 的小沟

• SYBR Green 仅在与双链DNA 结合后发出荧光。

• 变性过程中，DNA 双链分离，没有荧光

• 在复性和延伸过程中，形成双链DNA，并且SYBR Green 发出荧光。 在这个阶段

分段收集荧光信号

优势

 对DNA模板无选择性----适用于任何DNA 

易于使用 - 无需设计复杂的探头

非常敏感

便宜的

缺点

 容易与非特异性双链（如引物聚合物）DNA结合dnastar引物设计，导致假阳性，但

可以通过优化反应条件来改变，需要熔解曲线

不支持多种荧光设计

方法2----

工作机制

Ø 荧光标记发夹探针

Ø 茎由互补的配对序列、与靶序列互补的5-7个核苷酸环和15-30个核组成。

分子信标会形成一条链，荧光基团激发后产生的光子被该基团猝灭。

通过淬灭，荧光团产生的能量以红外线而不是可见光的形式释放。

优势

 高特异性，是检测目标序列中SNP最灵敏的试剂之一

 高灵敏度，可检测低至1拷贝的核酸

缺点

 只能用于一种特定目的

设计难点

价格相对较高

方法三----方法

工作机制

A。 可水解杂交探针与目标序列互补 • 5' 端标记有报告基团

(,R)，例如 FAM™、VIC®、JOE™、NED™、CY3™、CY5™、

德克萨斯红® 等

b. 3'端标记有荧光猝灭基团（，Q），例如TAMRA™、MGB

（非）等。 • 探针完好无损，R 发出的荧光能量被Q 基团吸收。

接收，无荧光； R和Q分离并发出荧光。 每扩增一个 DNA 分子，就会释放一个 DNA 分子。

在循环过程中可以检测到荧光信号。 Taq 酶具有 5'→3' 核酸外切酶。

酸酶活性、可水解探针

优势

 a. 目标序列高度特异性 

b. 设计相对简单——与目标序列的某个区域互补。

C。 重现性比较好 

d.支持多种荧光设计

缺点

a. 委托公司标记，价格较高

b. 很难找到低背景的探针

实时荧光定量PCR在科研和临床中的应用

• 定量-DNA 定量

-RNA定量

• 定性SNP 分析

-基因型分析

-RNA变异分析

-熔解曲线分析

- 正负识别

实时 PCR - 定量数据处理简介

1）绝对定量检测起始模板数量的精确拷贝数，通常使用标准曲线。

A。 至少 5 个具有不同浓度梯度的标准品，覆盖未知的样品浓度。

b. 每个点重复 3 次

C。 添加 NTC 以检测可能的污染

d. 将未知样品的Ct值代入公式，得到起始浓度 X0 2 5

2) 不同处理样品中目标转录本之间基因表达差异的相对定量测定

不同的。

(1) 相对值(ΔCT)——未内参基因归一化——以质量单位为标准

– 准确量化起始材料

(2) 表达一致——考虑初始样本的差异——以内参基因为标准——a

或在所有测试样本中一致表达的多个已知参考基因

竞争性PCR

• 竞争性PCR 是指在同一反应管中同时扩增目标基因和参考标准。

测试标准用作对照来估计特定目标 DNA 或 RNA 分子的相对量。

• 竞争PCR有效控制不同反应管之间扩增效率的差异。

竞争性 PCR - 理论基础

PCR扩增过程中，PCR产物的量用公式Y=A(1+R)n表示，其中Y代表PCR产物的量，A代表初始模板的量，R代表PCR的扩增效率，n代表PCR 当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。 — 相似的基因序列、相同的引物、相同的引物结合位点、相同的扩增效率。 最终混合PCR产物中，待分析样品与竞争底物最终产物的比例直观地反映了两者初始状态下核酸含量的比例。

多重+竞争 PCR - 优点

A。 高通量：每个反应孔可同时检测10个基因；

b. 经济：适合大样本多个基因同时检测，大大缩短实验周期，提高

实验效率。

C。 检测分辨率高：可有效区分低至15%的表达差异；

d. 良好的重现性：在已知浓度的 RNA 增量稀释后进行多重表达分析

线性关系良好R2>0.99；

e. 准确度高：目的/内参基因片段与内参基因片段序列基本一致

性质，确保最终扩增产物确实与初始模板量比例、一个或多个参数发生反应

照明基因和检测基因在同一管中反应，优化各基因的表达水平。

使用竞争性 PCR 进行精确测定。

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