1 背景知识介绍

进行 PCR 反应时需要寡核苷酸引物 (rs)。 我们需要设计与 DNA/cDNA 模板区域互补的引物。 当一次添加一个核苷酸时，核苷酸上的反应基团 ( ) 必须选择性地封闭 ( ) 和解除封闭 ( )。 引物的主要特点是它们必须与模板分子上的序列相对应（必须与模板链互补（ ））。

当然，引物不需要与模板链完全对应（例如添加酶切位点或构建突变位点的引物）； 但引物的3'端必须与模板DNA链完全对应（所以当我们添加酶切位点时，它是5'端），这样才能延伸。 通常3'端使用鸟嘌呤（，G）或胞嘧啶（，C），尽量不要有腺嘌呤（，A），引物的5'端通常有几个核苷酸延伸（）。 另外，杂交引物（ ）的3'端必须相互指向，因此我们在合成引物时，总是从5'端开始向3'端开始。

引物的长度对于扩增特定序列很重要。 短引物主要用于扩增小而简单的DNA片段。 另一方面，长引物用于扩增真核基因组 DNA 样本。 但是，引物不应太长（>30bp 引物）或太短（<15bp）。 当然，当我们的模板很纯的时候，引物就不受这些规则的限制，可以根据实际情况定义引物的长度。 短引物更不准确。 也就是说，非特异性DNA扩增产物增多，表现为电泳时出现很多非特异性条带。 长引物的缺点是它们导致杂交速率较慢。 平均而言，待扩增的 DNA 片段大小应在 1-10kb 范围内。 实践告诉我们，我们比较放大的长度是3Kb及以下，当然这也取决于物种。

（图1引物扩增示意图。PCR基因扩增方向与体内合成方向一致，即从5'端到3'端。）

引物设计还应注意以下规则：引物的结构应相对简单，无内部二级结构，避免内部折叠； 我们还需要避免引物-引物退火，这会产生引物二聚体并破坏扩增过程； 设计时如果不确定引物的某个位置放置什么核苷酸，可以在该位置包含多个核苷酸，这称为混合位点； 您还可以使用基于核苷酸的分子插入物（肌苷）来取代传统的核苷酸，以获得更广泛的配对能力。

考虑到上述信息，底漆通常应具有以下特性：

(1)长度为18-24个碱基；

(2)G/C含量40-60%；

(3)以1-2对G/C开始和结束；

(4)退火温度(Tm)50-60℃；

(5) 引物对之间的Tm差异应在5℃以内；

(6)引物对不应有互补区域；

（当然这是在比较理想的状态下，如果状态不理想，可以尝试以此作为参考）

2 NCBI引物设计实践

2.1 定量引物规则

最重要的是特异性（即只扩增需要检测的基因）。 其他规则（1）引物长度为20-21 bp； (2)避免引物中连续出现5个或更多相同碱基，如AAAAA或GGGGG； (3)每个引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间有3个氢键，以保证引物与模板连接的稳定性)； (4)GC含量为45%~55%； (5) PCR产物大小为85~300 bp； (6)引物应尽可能跨越内含子和外显子； (7) 参考上节引物设计规则； （八）其他。

2.2 NCBI设计定量引物

2.2.1 以NCBI查mRNA序列（以人TNF-α）为例

(1)寻找人类TNF-α基因。 方法如图2-1所示。 点击

（图2-1 NCBI检索人TNF-α基因）

(2) NCBI定位需要引物设计的基因并左键点击。

（图2-2 选择我们需要研究的TNF-α）

(3)TNF-α相关信息()

因为我们只是设计引物，所以不需要阅读太多的信息。 但值得注意的是，有些基因有很多剪接体，因此选择合适的剪接体非常重要。 如果我们知道具体研究哪个拼接体，直接选择即可； 如果我们不知道要研究哪个剪切体，只需选择最长或研究最多的剪切体即可。

（图2-3 TNF-α剪接体信息，共包含1条信息，用于qPCR引物设计）

（4）点击：.4进入mRNA详细信息页面（）

A。 查看信息，包括每个外显子、内含子和 CDS 区域

（图2-4查看外显子、内含子和CDS区域信息，因为设计是为了跨越外显子-内含子）

b. 第一个外显子在1-363之间，CDS区域在178-897之间。 让我们学习一下定量引物设计的规则。 一般定量引物会选择mRNA的前500bp或者第一个外显子或者CDS，所以这里我们选择TNF-α的前600bp（当然具体长度可以适当改变）用于定量引物设计（序列可以复制或另存为文件）。

(5) NCBI引物设计

这里我们使用NCBI的BLAST功能选项进行设计

(a) 打开NCBI网站()dnastar引物设计，找到BLAST选择框，如下图红框所示；

(b)找到“-BLAST”选择框并左键单击

(c) 新页面优先：输入基本序列，或从文件中拖动序列； 然后限制上下游引物的起始位置（记住qPCR产物在85-300bp之间的约定，其他规则软件会自动设置（固定的，不用担心），这里我们选择1-150的位置设置为上游（ ）-200-500 下游（ ）；产品长度设置为85-300，如下图所示。

(d) 点击本页底部的“获取”；

(e) 检查并提交序列所属基因信息，勾选复选框并点击“”；

(f)等待界面，软件设计引物需要时间，几分钟甚至更长时间，等待即可……；

(g) 获取引物信息。 这里需要检查引物的特异性，检查引物下面是否还有其他mRNA信息。 如果不包含，说明该引物特异性极高，只能扩增我们需要的mRNA（TNF-α）。

(h) 保存所需的qRT-PCR引物（当引物较多时，以最上面的引物为主，为了使实验尽可能成功，建议合成两对或更多对定量引物）

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7定量引物设计实践

俗话说，有太多的技能需要克服。 这个概念对于设计引物也是一样的。 在极少数情况下，NCBI 设计的引物可能无法用于实验。 例如，熔解曲线不是标准峰（非单峰），不能靶向基因。 靶向效率低等。 因此，为了实验的成功，掌握另一种设计定量引物的方法是极其有必要的。 对了，文末附上了oligo 7的下载位置，不然你就说我流氓了！

3.1 寡核苷酸引物设计规则

具体规则如上所述。 只要回头看看。 如果你还不知道如何露手或露屁股dnastar引物设计，我就打你三巴掌，让你再做一次。

3.2 使用oligo 7设计定量引物

(a) 打开oligo 7软件

(b) 点击：file-new，然后将序列粘贴进去，点击红框中的“√”；

(c) 点击“- for & probs...”，然后选择“probs & ”/当然，你也可以选择“PCR”，但是会很多，所以点击“”即可；

(d) 获取引物信息

e) 保存定量引物，一定要选择要保存的引物，“文件-保存-”，选择位置（如果找不到，别怪我没说清楚）并给它命名；

上游底漆：

下游引物：

(f) 合成引物（导出的引物都是5'端到3'端，直接发送合成即可）：

:交流电

:CTC

（对了，导出的引物序列需要软件打开，最后也发到这里（），下载地址：；提取码：1179）

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