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RT-PCR质粒设计应遵循的主要原则是：

(1) 设计质粒并在核苷酸保守区保持特异性；

(2) 质粒的厚度通常为15-30bp，GC浓度通常为40%-60%；

(3)质粒模板序列的Tm值应保持在72℃左右；

(4) 质粒3'端的核苷酸符合四个“不”：

一“不”：不使用A，二“不”：不出现连续3个以上的核苷酸（如GGG和CCC），三“不”：不互补、二聚体或头饰结构，四“不”：不能停在密码子的第3位；

(5) 核苷酸随机分布，质粒本身与质粒之间严禁出现四个连续的核苷酸互补； 6. 引物3'端的ΔG值低，5'端和引物中部的ΔG值高，呈余弦曲线状。

PCR质粒设计常用的软件有《Oligo》、《》、《》等，操作比较复杂，对于科研初学者来说比较困难。

明天给大家介绍一种适合菜鸟的质粒设计方法，特别适合刚入门的菜鸟。

网站 1：

网站 2：

打开网站，单击“全部”下拉选项，然后选择“基因”。

在方框内输入目标基因（以Akt为例），如图搜索Aktdnastar引物设计，可以看到显示了很多Akt基因，选择对应的物种，比如rat（家鼠），rat（大鼠） , human（人类）等，这里需要选择大鼠（）物种的Akt。

打开Akt1，下拉网址，在NCBI()中选择(s)，点击.1，复制Akt1的基因序列。

如何进行质粒设计？

打开（生工官网），点技术服务，点 Free ，将上面复制的基因序列复制进去，按提示要求检查（以大鼠Akt基因为例，如下），提交质粒设计清单。

如何查看质粒设计结果？

点击质粒设计列表，查看结果可以看到Akt基因设计的质粒。 在合成质粒之前，我们需要对设计好的质粒进行BLAST验证。 通过软件模拟，我们可以看到它是否可以放大我们的目标基因。 .

如何对质粒进行BLAST验证？

打开网站，下拉，点击-BLAST，复制上面设计的质粒，将选项改为 (taxid:10090)（根据品系选择dnastar引物设计，本例为大鼠品系），最后点击Get for BLAST验证（结果需要等待几秒），观察结果，如果验证得到的基因是Akt，即设计的质粒符合要求，可以用于PCR实验。

以上就是借助两个网站进行质粒设计的步骤，是不是很简单？ 希望对刚入实验室的男士有所帮助！

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