文章类型：科研软件操作

阅读时长：6分钟

1 软件概述

在分子生物学领域有多种用途，涵盖多种检测手段。比如，可用于测定基因序列、观察质粒结构、制定引物方案、预演琼脂糖凝胶电泳过程、比较序列差异等任务，能够使后续实验数据的解读更加方便。接下来，将介绍这款软件在常用分析方面的使用情况，当前版本为6.0.2。

2 引物设计

可以轻易完成目标片段合成引物、qPCR引物（NCBI）的拟定等步骤；同时能够产出符合要求的序列，详细步骤如下：

借助NCBI数据库查找目标基因的CDS序列，输入基因标识，通常选用“Gene”数据集，同时指定物种种类，例如“human”或“Mouse”。

比如键入基因标识为“PTEN human”，然后点选，就能得到基因的详细信息页面。

直接下拉页面找到“PTEN human”，或者点击右侧的“NCBI ()”，查找以“NM_”为前缀的mRNA序列，然后进入该序列页面。

通过滑动屏幕定位到编码序列，点击该序列后继续上滑至页面顶部，确认已选中基因片段，比如846-，随后选取“FASTA”格式dnastar引物设计，并复制出所选编码区域的序列。

FASTA序列

启动程序，选择“创建DNA或RNA文档”，然后复制NCBI中的CDS序列粘贴进来，并将文件更名为PTEN。

新建DNA文件

（6）接着，选择“可以”获得导入序列的图谱。

按下界面下方“序列”按钮，切换到导入的基因DNA片段，此刻可以针对这个片段开展引物设计工作。

引物设计时，优先选用序列的首段或末尾部分，长度为18至35个碱基对，点击菜单中的“引物”选项，再选择“添加引物”，随后确定是选择顶部链还是底部链，为引物命名，最后将其添加到模板中

（9）点击窗口底部“引物”，查看引物详情。

此外，若目标基因的引物设计与质粒图谱的酶切位点关联性较强，软件能迅速检索并附加引物的酶切位点，例如通过选择“工具（N）”—“限制性酶（比如NotI、XhoI）”—“复制识别序列”—“双击正向引物”—“编辑引物附加酶切位点”，即可重新获取该引物。

引物改进包括加入保护碱基G或C来调整退火温度Tm，这个温度通常在58到60摄氏度之间。设计引物时需遵循相关规定，确保G-C碱基对的比例维持在40%到60%。为了优化引物长度，有时会移除某些碱基，使得引物长度通常介于18到35碱基对之间。同时，可能会增加碱基以修正目标序列，并重新筛选引物。最后，利用-BLAST和PCR等方法验证引物的性能。

3 质粒图谱的打开、编辑

以.1（+）为例：

（1）选择“打开文件”，打开.1（+）质粒图谱，如图所示。

（2）查看载体序列，酶切位点分析等。

进行PCR模拟时，先在操作选项里找到聚合酶链式反应PCR功能，接着把设计好的引物加上，同时给生成的片段取个名字，然后保存文档，这样就能开始进行PCR扩增的仿真实验了。

质粒构建进行模拟，首先需打开目标质粒，即.1（+）质粒。接着，在软件界面中，依次选择“行动”菜单，再点击“限制和插入片段克隆”，最后选择“插入片段”功能。在弹出的选项中，先从“载体”和“片段”两个区域分别选取来源，即“载体”选“.1(+).dna”，“片段”选“PTEN.dna”。之后，需要挑选合适的酶切位点，可以选择NotI或XhoI。模拟过程中dnastar引物设计，可以观察克隆的具体步骤，并且为最终获得的克隆产物取一个名字。最后点击“克隆”可模拟质粒构建过程。

凝胶电泳模拟流程如下：先在菜单中找到工具选项，再点击模拟琼脂糖凝胶电泳功能；接着挑选需要模拟的电泳结果并确认；系统会生成相应的电泳图谱；用户还可以自行调整泳道数量，或修改凝胶类型与浓度参数。

质粒构建完成之后，经常需要对其进行序列分析，同时进行多序列对比，以验证其正确性。比如，当质粒构建成功时，通常会将它送到专业的测序机构进行检测，这些机构会提供正反两个方向的测序结果，比如使用正向引物（T7）获得的序列（T7-seq.），以及使用反向引物（BGH）得到的序列（BGH-seq.）。点选右箭头，进入显示对比功能，勾选参照序列选项，再选择开放序列比对模式，随后确认操作或从菜单中选择工具，同样勾选参照序列并选开放序列，就能对克隆片段进行碱基对比，并检视对比情况。

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