基础实验中，分子克隆是不可或缺的环节，其流程相当复杂，若想掌握，必须加入熟练操作的团队，反复观摩多次，不建议个人摸索学习。

如同污渍清除般，程序繁复，只要未显现条带，每项环节均存疑虑。回想初次从事分子克隆时，耗费许久却未获任何克隆，因而无法判定是哪个环节出了差错。当培养皿中终于出现一个克隆，我已濒临失控，完全无法想象会有理想结果。有一个友善的同门dnastar引物设计，顺便为我挑选了克隆体，结果发现其中一个是成功的，这样我就确认自己的实验步骤没有错误，此后分子克隆就成了常规操作。

分子克隆过程中，最让人头疼的部分，其实是PCR技术，这项技术的核心作用，是取得目标片段，并将其最终插入到载体中，引物设计在PCR实验里，占据着关键位置，为了让大家对此有更深入的理解，豆子老师特意准备了一节关于常规qPCR引物设计的基础课程，作为预习内容

谈及豆子老师的讲述方式，我颇有好感，其行文沉稳，毫无浮华之气。在铺陈故事的同时，他常常融入个人感悟与思考，这对初涉此道者颇为适宜。

以下是今天的正文。

本次讨论将涉及引物构建，因为基因合成过程中必须添加保护碱基和酶切位点，这一点或许初期难以领会，因此我们先研究普通qPCR的引物构建dnastar引物设计，以便对引物构建获得基本认识，先掌握在线构建引物的方法以及构建引物时需要留意的事项，接着探讨可用于构建引物的软件和blast，最后分析启动子引物的构建。

先以CYLD用NCBI在线设计一下引物：

若你无意探究过多细节，那么此处所述便已足够，对于你的目标基因，选择Pick即可，其查找方法前文已有论述，多数参数在工具里已默认配置，我们仅需修正PCR产物尺寸介于50至250之间，引物Tm值无需改动，物种信息你已选定，并在相应位置将Max Poly-X设定为3，随后点击“获取”，便可静候结果呈现。

后续将说明具体流程和选择该方法的缘由，关于从NCBI获取基因信息的操作环节，我们先前已有分析，现在直接展示结果即可，其位置在右侧区域

点击Pick ，进入引物设计页面

PCR区域会显现相应编号：.2，若已拥有序列，可直接在方框内粘贴，右侧的Range区域用于设定正反向引物结合区间

向下滚动可找到引物参数区域，首两行为引物序列部分，若已备有引物，可据此开展特异性检测，不过该步骤在引物构建时并不涉及，无需关注。PCR尺寸这一栏，能够设定PCR引物扩增后片段的长度区间，针对qPCR而言，将范围设为50到250比较准确，可以先设定一个较窄的范围，例如80到150，倘若在此区间内未能设计出合适的引物，便可以重新调整，把产物大小区间放宽。引物数量基准为10对，不足此数时，实际对数即显示数量。每行针对引物的Tm值，可分别设定最大值、最小值和理想值，同时还能规定正反向引物Tm值的最大差距。就qPCR而言，理想的Tm值应为60℃，无需进行任何调整。

所有生物体的基因结构都包含非编码区与编码区，而经过加工的RNA分子仅保留编码部分，不含非编码区，所以在构建实时荧光定量PCR的引物时，通常选择跨越编码区的方法，以确保引物不会与基因组DNA发生反应，此时可能会疑惑我们讨论的是RNA，为何会与基因组DNA发生反应，因为在提取RNA的过程中，虽然可以操作使RNA样本中的DNA失活，但很难确保DNA完全失活，而样本中残留的基因组DNA会严重影响最终检测结果。

Tool界面顶端设有三个不同设定，分别是：允许外显子跨越、要求引物对中至少一个跨越外显子，以及引物无需跨越外显子。需留意，若选用后两种选项，PCR模板区域必须填入NCBI序列的准确编号，例如mRNA的NM编号，此举是为了让系统准确辨识外显子的拼接位置。如果手动粘贴序列，则会因为无法定位外显子而设计失败。

向下滚动是关于引物特异性检测的说明。引物特异性旨在确保扩增过程仅产生目标片段。务必确认顶部列表中已勾选相应选项。模式通常直接选用默认设置，因为当输入序列时，系统会提示该序列可能存在于多个变异体中，并在比对数据库时予以显示，从而帮助用户筛选出需要检测的PCR模板。特异性检测所依据的数据库因检测目标而异：针对检测基因表达水平的升高或降低，通常选用mRNA作为分析对象，因为PCR检测的基础是mRNA的逆转录产物；若需检测其他RNA类型，则应选用包含范围更宽泛的RNA数据库。当PCR模板为基因组DNA时，应选择相应的基因组数据库。在实验过程中，需考虑预测序列的准确性，同时排除环境样本或不可培养样本序列的干扰。这是指样本的物种种类，在物种名称选项区域，挑选出相应的物种名称即可。或者能够直接键入物种编号，例如：人类对应9606，小鼠对应10090，大鼠对应10114。在下方位置，可以调整特异性标准，比如规定引物与非特异性结合位点之间，至少需要有若干个碱基不匹配的情况。在Allow这一项里，可以打勾，让引物具有基因专一性，就是说它能够和这个基因的不同转录形式都发生作用。不过要明白，这个设置只能确保做出的引物能和多个转录形式配对，却不能保证所有转录形式都能被探测到。

对引物参数进行修改时，可以调整特异性检测指标、引物分子大小、GC含量区间，通常将最大重复碱基数设定为三，不允许引物序列里存在三个以上连续相同的核苷酸，点击获取按钮，即可得到相应结果

这就是我们得到的引物，每个引物的详细信息都可以看到。

先前内容仅使读者对引物构建获得初步认识，并观察其中涉及的部分指标，现在我们需对引物构建的相关指标及必须留意的要点进行更深入的剖析。

（1）引物长度

产物的特异性以及PCR反应中的退火温度，均受到引物长度的影响。引物的长度通常介于15到30个碱基对之间，较为理想的是在18到27个碱基对范围内，但不应超过38个碱基对。当扩增产物长度小于500个碱基对时，引物长度达到18个碱基对即可满足要求。若扩增产物长度介于4到5千个碱基对之间，引物的长度则不应低于24个碱基对。同时，上下游引物的长度差异不应超过3个碱基对。引物每增添一个碱基,其识别能力会增强四倍。序列过短时,容易产生错误配对,从而削弱识别效果；长PCR引物有助于提升扩增的精准度,但过长的引物往往更容易形成发卡结构、二聚体或自身互补等非特异性构象,而且引物长度超出一定范围后,其延伸所需温度会超过74摄氏度,即高于Taq酶的最佳工作温度。

（2）引物碱基

PCR引物中GC碱基与AT碱基的比例，需要和目标模板的GC/AT比例相匹配或略高，这样才能保证扩增效果。GC碱基的含量通常设定在40%到60%之间比较合适，其中45%到55%是最理想的范围。如果GC含量偏低或偏高，都会对扩增过程产生不利影响。GC含量偏低时，引物的熔解温度会偏低，从而降低PCR反应的特异性。而GC含量过高时，则容易引发非特异性扩增现象。引物中的四种碱基应当均匀散布，不宜让五个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸连续出现，例如GGGGG这样的情况要避免，同时也不应存在两个核苷酸的不断重复，诸如这样的序列也不可出现。引物两端的GC含量应尽量接近，不要差距过大。附加的序列要加在引物的5'端位置，计算熔解温度Tm值时不需考虑这部分序列，但在评估其互补性和二级结构时，则必须将它们纳入考量范围。引物组合的熔解温度相差幅度须在5℃以内，确定温度值与GC比例是核心考量，实施联合扩增时，更需使温度设定接近，至于引物附加尾部，其作用甚微。务必牢记所有设计的引物都必须进行BLAST检测，这一点我们将在后续内容中详细说明，倘若两个引物的熔解温度存在差异，应将退火温度设定为低于较低熔解温度5℃，或者为增强特异性，可以先以较高熔解温度为基础的退火温度执行5个循环，之后再以较低熔解温度为基础的退火温度完成剩余循环。

（3）引物Tm值

DNA解链温度，是指DNA双螺旋构造被破坏一半时的热度，通常在55度到65度之间。如果引物长度不足20个碱基，其Tm值可以通过Tm等于4乘以G和C的数量加2乘以A和T的数量来大概计算。对于较长的引物，其熔解温度的计算需要依据热力学相关参数，具体通过“邻近基”的计算方法进行，这也是当前引物设计程序普遍采用的方法，Tm = H/(S + R * ln (C/4)) + 16.6 log (/(1 + 0.7 ))-273.15，多数软件都内置了熔解温度的计算功能，因此无需担忧。

（4）引物的二级结构

引物末端碱基的选择很有讲究，3’端尤为关键，5’端相对次要，在3’端位置不宜采用A或AA连续出现，更不能有AAAA这样多个A相连的情况A在错误诱发的位置上引发作用较强，3’端碱基以G或C为佳，但连续的G或C不应超过三个，否则引物会在G+C含量高的区域错误引发，5’端序列对PCR影响不大，同时3’端不宜以密码子的第三位结尾，因为密码子的第三位容易出现简并，从而降低扩增的特异性和效率。引物之间发生结合可产生引物二聚体，这种二级结构由相同或不同的引物构成，可在序列一致的引物对或正反向引物间构建，其中3'端的相互匹配尤为突出，3'位点上的配对极易诱导引物二聚体生成。该物质会促使引物形成二聚体从而降低目标序列的扩增效率，因为引物二聚体的能量水平很高（超过4.5kcal/mol），不仅容易导致非特异性扩增产物出现，还可能因降低引物实际含量而干扰PCR反应的常规操作。

发卡结构的出现源于引物内部分子间的互补碱基相互结合，引物自身盘绕形成特定形态，这种结构仅需三个相邻碱基能够匹配即可完成。发卡结构的稳固程度能够通过自由能数值来评估，该数值由碱基配对时释放的能量与DNA折叠成环状结构时消耗的能量共同决定，当自由能数值为正值时表明结构并不牢固，因此不会对后续反应造成阻碍。若能量值偏低，该构造能够影响反应过程，发夹构造特别要防止引物三端出现发夹构造，否则会极大妨碍DNA聚合酶的延伸工作。

引物若与目标序列以外位置结合，则扩增效果会显著变差，目标片段信号会减弱或产生偏差。3’端若连续多个碱基不能准确配对，出现偏差的概率会更高，因此引物3'端的碱基，尤其是最后两个，必须精确匹配，以防末端碱基错配造成PCR实验无法成功。引物配对时，模板序列必须完全匹配，不允许出现任何偏差。完成引物构建之后，强烈建议进行blast分析，以确认目标物种的基因组中不存在高度相似的序列。

（5）引物的保存

引物通常以粉末形态进行运输。建议在TE溶液中重新溶解引物，确保其最终浓度为100微摩尔。使用TE溶液优于去离子水，因为去离子水的pH值常常偏酸性，容易导致寡核苷酸发生水解。引物的稳定性受储存条件影响。干粉形态的引物以及已溶解的引物都应该储存在-20摄氏度环境中。当引物以超过10微摩尔的浓度溶解于TE溶液时，在-20摄氏度下可以稳定保存长达六个月，而在室温条件下则难以保存超过一周时间。干粉引物在零下二十度条件下，能够存放长达一年时间，而在常温状态下，其保存期限最多为两个月。

关于设计引物的一些应用软件，可以先有个初步了解，以后我们会逐步掌握，比如Oligo，还有各种网络上的工具。

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