基本原理

聚合酶链反应，也就是PCR ，是一种体外特定核酸序列扩增技术，它模拟DNA的天然复制过程，由变性、复性、延伸三个基本反应步骤构成，根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物dnastar引物设计，这两个引物分别与DNA的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物，与四种脱氧核糖核苷三磷酸即dNTP .DNA聚合酶以及含有靶序列片段的模板DNA分子相混合，经过高温变性这一阶段，也就是使DNA双链解开，再经过低温复性阶段，即让引物与模板附着，然后经过中温延伸阶段，也就是合成新的DNA片段，经过这三个阶段的一次循环，DNA的量就会增加一倍，那么经过30次循环后，DNA的量会增加230倍。

典型的PCR反应体系和PCR的三个阶段

典型的PCR反应体系构成：

PCR的三个阶段如下:

加热模板DNA至约94℃一定时长，促使模板DNA双链或者经PCR扩增而形成的双链DNA解离成单链，以此让其能够和引物结合，为下一轮反应做好准备，这便是模板DNA的变性；温度降低到约55℃时，引物与模板DNA单链的互补序列进行配对结合，此为模板DNA与引物的复性；DNA模板 - 引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，把4种dNTP当作反应原料，以靶DNA序列作为模板，依据碱基配对以及半保留复制原则，合成一条新的和模板DNA链互补的半保留复制链，这就是引物的延伸。进行重复循环，先是变性，接着复性，然后延伸，如此一来，便能够获取更多的半保留复制链，并且这种新的链又能够成为下一次循环的模板。

实验用品

1.材料

枯草芽孢杆菌 AS 1.398基因组DNA溶液

2.试剂

3.仪器

实验步骤

引物设计

于NCBI那儿查询关于(ALP)的基因序列，将subsp. str.168的碱性磷酸酶基因序列充当模板来设计引物，依据DNA序列以及所选用的表达质粒载体pET - 28a - c(+)的图谱，借助5.0这一软件设计了两对引物，在上游引物以及下游引物之上分别设定BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，这两个不一样的限制性内切酶识别位点分别于引物之中以划线的形式标记出来，引物序列如下:。

上游引物:

5'--3'(BamHⅠ)

下游引物：

5'-TTTTT-3'(Hind Ⅲ)

基因扩增

把提取出来的基因组DNA当作反应的模板，借助合成的引物，针对编码ALF的DNA序列展开PCR反应来进行扩增。

加好上述试剂之后，进行离心操作这一动作5秒钟之际，要将其混匀，而后添加20微升石蜡油放在混合物之上，以此防止在PCR过程当中样品所含水分出现蒸发的情况。

反应全部告一段落之后，将PCR仪的温度安置成维持在4℃ 的状态。反应结束情形下，各自提取5μL 运用1%琼脂糖凝胶电泳予以检测，对于基因长度约有着。拿加样DNA充作执行电泳事项。等到电泳结束，基于凝胶成像系统来观察相关结果并且为其拍照。

产物纯化

采用DNA纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下:

PCR结束之后，把反应液从PCR反应管移至洁净的1.5mL离心管里，添加4倍体积并混匀。把纯化柱放进收集管，将混合液转移至柱内，在室温放置2分钟。

(2)12000 r/min 离心1min。

（3）把收集管里的废液倒掉，把纯化柱放进同一个收集管内，加入600μL，以12000转每分钟的转速进行离心，时长为1分钟。

(4）重复步骤(3)一次。

(5)把收集管里的废液倒掉，然后将纯化柱放置到同一个收集管内，以每分钟12000转的转速进行离心操作，持续2分钟。

把用于实验操作的3S柱，放置到另一支1.5mL离心管之内，选取适当温度的环境dnastar引物设计，在处于纯化柱膜中央的位置，添加30μL 的TE，将其放置在恰好设定在37℃的环境里，持续放置2分钟 。

将其在转速为12000转每分钟的条件下进行离心操作，时长为1分钟，之后，位于离心管当中的液体便是回收得到的DNA片段，该片段能够立刻投入使用，或者保存于零下20摄氏度的环境下留作以后备用。

注意事项

PCR反应灵敏度极高，为防污染，所用的0.2mL的管要全新、无污染且无酶，吸头也要全新、无污染且无酶，实验操作要戴一次性手套，操作要尽量在无菌操作台上开展。

⒈使用工具酶的时候必须在冰浴条件下进行相关操作⒉使用DNA样品的时候也必须在冰浴条件下进行有关操作⒊使用之后要是有剩余的情况⒋那就应该立刻把它放回冰箱中 。

3.应设含除模板DNA外所有其他成分的阴性对照。

4.引物使用的浓度，一般是在0.1至1.0μmol/L之间，要是浓度过高的话，就容易形成引物二聚体，或者增加非特异性产物，要是浓度过低的话，就会影响效率。

进行PCR产物的纯化以及回收之前，需要先对PCR产物开展电泳鉴定，以此获取分子大小保持一致的目的条带，。

结果分析

对PCR产物的DNA凝胶电泳结果进行拍照并分析。

如有侵权请联系删除！