大家好，博鳌经典中药检测技术知识分享系列今天正式启动。 今天给大家分享的是理论部分的第一期：

实验方法原理

PCR技术的基本原理与DNA的自然复制过程类似，其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由三个基本反应步骤组成：变性-退火-延伸：

①模板DNA变性：将模板DNA加热至94℃左右一定时间后，模板DNA的双链DNA或PCR扩增形成的双链DNA解离，变成单链以便它能与底漆结合。 准备圆形反应；

②模板DNA和引物退火（复性）：将模板DNA加热变性成单链后，温度降至55℃左右dnastar引物设计，引物与模板DNA单链的互补序列配对；

③引物延伸：DNA模板-引物缀合物以dNTP为反应原料，在Taq酶的作用下以目的序列为模板。 根据碱基配对和半保守复制的原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。 半保守复制链。

通过重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以获得更多的“半保留复制链”，这条新链可以成为下一个循环的模板。 完成每个循环需要2至4分钟，待扩增的目的基因可在2至3小时内扩增数百万倍。

实验材料

1. 试剂和试剂盒

2、仪器及耗材

模板DNA

PCR机

脱氧核糖核酸

移液枪

聚合酶

PCR板

蒸馏水

薄壁管

PCR缓冲液

离心管

底漆

离心管盒

氯化镁

实验步骤

1. 标准PCR反应体系

10×扩增缓冲液

10ul

4 dNTP 混合物

每个/升

底漆

各10～100 pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶

2.5u

镁2+

1.5毫摩尔/升

添加双蒸水或三蒸水直至

100ul

2. PCR引物设计

PCR反应中有两个引物，即5'引物和3'引物。 设计引物时，使用单条 DNA 链作为基准（通常基于信息链）。 5'端引物与待扩增片段5'端的短DNA序列相同； 3'端引物与待扩增片段5'端的序列相同。 3' 端的短 DNA 序列是互补的。

1. 引物设计的基本原则

(1)引物长度：15-30 bp，常用的是20 bp左右。

(2)底漆基料：G+C含量优选为40-60%。 G+C太少，扩增效果差，G+C太多，容易产生非特异条带。 ATGC 最好随机分布，以避免超过 5 个嘌呤或嘧啶核苷酸的簇。

(3)引物内部不应有互补序列。

(4) 两条引物之间不能有互补序列，特别是3′端互补重叠。

(5)引物与非特异性扩增区的序列同源性不应超过70%。 引物3'端的8个连续碱基在待扩增区域之外不得有完全互补的序列，否则容易导致非特异性扩增。

(6)引物3'端的碱基，特别是最后一个和倒数第二个碱基应严格配对。 最好的选择是G和C。

(7)引物的5'端可以被修饰。 如添加限制性酶切位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，以及添加其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2. 引物设计软件

.0（自动搜索）*、（底漆评估）、NTI Suit、、Omiga、、（在线服务）。

3. 模板的准备

4. PCR反应条件的控制

5. PCR 循环参数

6. PCR 步骤

看看第二步实验你有没有头晕dnastar引物设计，小编省略了第三、四、五、六步的介绍。

您只需了解PCR原理，剩下的由博鳌经典中药检测PCR试剂盒完成。 无需繁琐的试剂配制、引物设计等； 您只需区分套件 A 和套件 B 即可。

本知识分类系列的发布，是为了与广大中药检测同仁交流、沟通、进步。 欢迎大家留言交流。

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