您好，博鳌经典草药计量技术知识分享系列明天开始，明天给大家分享第一部分理论部分：

实验方法原理

PCR技术的基本原理与DNA的自然复制过程类似，其特异性取决于与目标序列两端互补的寡核苷酸质粒。

PCR由三个基本反应步骤组成：变性-固溶-延伸：

①模板DNA的变性：将模板DNA加热至94℃左右一定时间后，模板的双链DNA或PCR扩增产生的双链DNA解离，成为单链，便于与质粒结合。 回合反应计划；

②模板DNA与质粒固溶（复性）：模板DNA加热变性成单链后，温度降至55℃左右，质粒与模板DNA单链的互补序列配对；

③引物延伸：DNA模板-质粒结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，以目的序列为模板，根据核苷酸配对和半保守原理合成新的互补模板DNA链复制 半保守复制链。

通过重复循环变性-溶液-延伸三个过程，可以获得更多的“半保留复制链”，但这些新的链可以成为上一个循环的模板。 完成一个循环需要2到4分钟，要扩增数百万倍的基因需要2到3小时。

实验材料

1. 试剂和试剂盒

2、仪器及耗材

模板DNA

PCR仪

脱氧核糖核酸

移液枪

聚合酶

PCR板

蒸馏水

薄壁管

PCR缓冲液

离心管

质粒

离心管盒

溴化镁

实验流程

1. 标准PCR反应体系

10X 放大缓冲液

10ul

4 dNTP 混合物

个/升

质粒

每次10～

模板DNA

0.1～2ug

聚合酶

2.5u

镁2+

1.5毫摩尔/升

加入双蒸水或三蒸水

100ul

2. PCR 质粒设计

PCR反应中有两个质粒，5'末端质粒和3'引物。 设计质粒时，以DNA单链为基准（通常基于信息链），5'端质粒与位于待扩增片段5'端的一小段DNA序列相同; 3' 端的一小段 DNA 序列是互补的。

1. 质粒设计的基本原理

(1)质粒宽度：15-30bp，通常在20bp左右。

(2)质粒核苷酸：G+C浓度优选为40-60％。 如果G+C太少，扩增效果不好，如果G+C太多，则容易出现非特异性条带。 ATGC 最好随机分布dnastar引物设计，以防止超过 5 个甾醇或吡啶碱基的簇。

(3) 质粒内部不应出现互补序列。

(4)两个质粒之间不应有互补序列，特别是要防止3'端互补重叠。

(5) 质粒与非特异性扩增区域序列的同源性不应超过70%，且质粒3'端的8个连续核苷酸在待扩增区域之外不应有完整的互补序列，否则容易造成非特异性扩增。

(6) 质粒3'端的核苷酸，特别是最后一个和倒数第二个核苷酸，应严格配对，最好的选择是G和C。

(7) 质粒的5'端可以进行修饰。 如添加限制性酶切位点、引入突变位点、使用生物素、荧光物质、地高辛标记、添加其他短序列dnastar引物设计，包括起始密码子、终止密码子等。

2. 质粒设计软件

.0（手动搜索）*，（质粒评估），，，Omiga，，（在线服务）。

3. 模板准备

4. PCR反应条件的控制

5. PCR循环参数

6. PCR 步骤

看到第二步实验就已经很头疼了，小编已经省略了第三、四、五、六步的介绍了。

您只需要了解PCR原理，剩下的就由博鳌经典中药检查PCR试剂盒来完成。 无需复杂的试剂配制、引物设计等； 只需要区分套件A和套件B即可。

本知识分类系列的发布，就是为了与广大药检朋友交流、交流、进步。 欢迎您留言交流。

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