我们都清楚，RNA的碱基是由腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤以及胞嘧啶这四种基本碱基所构成的。其中，尿嘧啶乃是RNA与DNA区分开来的关键特性所在。其中，A会与U进行配对，此配对会形成2个氢键。并且，G会与C进行配对，这一配对会形成3个氢键。而G偶尔也能够与U进行配对，(这种配对会形成2个氢键，尽管其较为微弱，不过在RNA结构里是颇为常见的)。相比RNA，DNA里的胸腺嘧啶（T）比尿嘧啶（U）多出一个甲基，于DNA本身而言，这使得它更稳定些，进而更适宜作为遗传物质去长期存储信息。并且，细胞比较容易识别以及修复DNA中出现的U（一般源自C脱氨所产生），要是RNA使用T的话，细胞会难以判别这究竟是正常的碱基还是损伤。所以，相较于DNA，RNA具有不稳定性。在常规的分子检测里，对于病原体RNA的扩增，采用的是逆转录法。即先针对RNA，将其逆转录成为cDNA，之后再针对cDNA展开PCR扩增，而非直接针对RNA模板链进行扩增。原因如下：

1.RNA分子本身不稳定，难以直接操作

RNA容易降解，它是单链结构，核糖的2‘-羟基让其在化学上更具活泼性，极容易被环境里到处都有的RNase（核糖核酸酶）降解，RNase十分稳定并且难以使其灭活，一点点污染就有可能致使实验失败，把不稳定的RNA逆转录成更稳定的DNA双链，是进行长期保存以及分析的前提条件。

对二级结构复杂而言，单链RNA易于借助碱基配对去形成复杂的茎环之类的二级结构，这会对引物的结合予以极严重的干扰，还会对聚合酶的行进造成严重干扰，进而致使扩增效率低下，甚至导致失败。

2.关键技术工具 — PCR只能用于DNA

作用于DNA的DNA聚合酶，其天然模板为DNA，它仅能识别DNA，把脱氧核糖核苷酸连接成DNA链，它没办法读取RNA模板。逆转录酶是一座桥梁，它是一种特殊的DNA聚合酶，它能够以RNA去合成和其互补的DNA链（也就是cDNA，互补DNA）。只有经过这一步的“翻译”，把RNA信息转化为DNA信息，后续的PCR扩增才可以进行。

3.从cDNA扩增具有独特的生物学和实验优势

逆转录成为 cDNA 之后，能够将内含子进行剔除，进而聚焦于编码序列。在真核生物范围之内，基因的初始转录产物也就是 pre-mRNA ，其涵盖着外显子也就是编码区以及内含子也就是非编码区。mRNA 在成熟这个过程当中，内含子会被剪切掉。以 mRNA 作为模板合成而成的 cDNA ，仅仅只含有连续的外显子序列。这情形致使：

对基因表达展开研究，能够直接针对特定基因的成熟mRNA水平予以分析，并且不会遭受来自基因组DNA里内含子的干扰。

克隆表达，cDNA序列于有细菌等原核系统的背景下，能够直接插入表达载体，进而生产蛋白质，而这些原核系统不存在剪切内含子的机制。

为提升特异性而进行简化分析，基因组DNA极为庞大，其中一个基因或许含有多个长内含子，若直接拿基因组DNA当作模板去扩增某个基因，有可能要跨越很长的距离，这难度颇大，且产物也许会很长，若从cDNA进行扩增，目标片段通常更短且更集中，特异性更高，成功率也更高。

说到此处，不禁会去思索，既然逆转录法是把RNA逆转录成cDNA之后再开展检测，那么逆转录的进程会不会导致极大的偏差呢？特别是在进行测序之际？

在对病原体RNA开展测序之际，逆转录进程的确会带入潜在的偏向性，对测序结果的绝对精确性产生影响。测序仪“读不明白”RNA，主流的高通量测序平台的生化反应关键在于DNA聚合酶。它们的工作原理乃是合成DNA链或者检测DNA合成时所释放的信号。这些系统没办法直接读取RNA模板。而致使偏差出现的主要源头包括：

1.逆转录酶效率与偏好性

酶活性存在差异，不同的逆转录酶，针对不同的RNA模板，像是长片段的，高GC含量的，还有具有复杂二级结构的，其逆转录效率不一样，这有可能致使某些转录本被低估，或者完全丢失。

提前终止，逆转录酶在碰到 RNA 修饰、降解位点或者复杂结构之际，或许提前脱落，致使 cDNA 片段不完整，进而测不到 5‘端又或者完整全长，这对确定转录本精确起始位点而言是个挑战。

2.引物引发的偏差

逆转录开始时依靠引物，引物如何选择关系着我们 可以捕获到哪一些RNA， 这里的RNA是什么样的RNA：

Oligo(dT)引物，是针对mRNA的poly(A)尾的，这类引物存在的问题是，会偏向于捕获带poly-(A)尾的成熟mRNA，而将非poly(A)的RNA（如部分组蛋白mRNA等）漏掉，此外，对超长转录本而言，酶可能无法有效地到达5‘端。

随机引物，理论上能够捕获全部 RNA，其中涵盖 rRNA、tRNA 等，然而存在的状况是，对于不同种类的 RNA，其结合效率并非均匀一致dnastar引物设计，并且极易受到 RNA 二级结构的作用。

序列特异性引物，会被运用到目标RNA上，而这类引物所存在的问题在于，它仅仅能够被用于针对已知序列的特定RNA检测，却并不适用于全转录组发现。

3.PCR扩增偏差

于文库构建期间，针对cDNA开展PCR扩增之际，不同的片段，鉴于长度不一样，GC含量也有差异，所以其扩增效率存有不同情况（即PCR偏好性），这会致使高表达转录本被过度地代表，然而低表达转录本有可能被淹没掉，进而扭曲真实的表达量比例。

4.链特异性信息的丢失

能生成双链 cDNA 的传统逆转录方法，会把 RNA 模板原本是正链亦或是反链的信息给弄丢，而这对于反义转录研究以及精确界定基因边界来说是相当关键的，如今存在着链特异性建库技术，也就是在逆转录阶段加入特殊标记，然而它却让步骤的复杂性得以增加。

以上就是关于逆转录法检测 RNA的系列问题探讨。

那有没有可能，不经过逆转录，直接就对RNA开展扩增检测呢？下面针对这种可能性予以探讨。

首当其冲的是，在自然界当中，病原体内是存有专门用以负责RNA复制的核心酶的，也就是RNA依赖的RNA聚合酶，是的没错。

在天然状态下，进行 RNA复制的进程dnastar引物设计，几乎是完全于将RNA当作遗传物质的病毒，也就是RNA病毒的内部发生的。这些病毒自身会编码一种特别的酶，此酶便是RNA依赖的RNA聚合酶，目的是用以复制其RNA基因组。那么要是运用RNA依赖的RNA聚合酶来进行RNA扩增，会存在哪些难题呢？

1. RdRp缺少校对功能，和好多DNA聚合酶不一样，多数RdRp没有“纠错”校对活性，它的3'→5'外切酶结构域缺失，不存在3'→5'校对功能，这致使它在复制时错误率特别高（每复制一万到十万个碱基就兴许出错一回）。高错误率会致使病毒迅速进化的情况出现，这是RNA病毒像流感病毒、新冠病毒、丙肝病毒这类能够快速变异、躲避免疫系统以及产生耐药性的根本缘由所在。除此之外，还会造成病毒群体内部存在大量序列稍微有所不同的变异体。

2.若要达成RNA在体外的扩增，对于RNA依赖的RNA聚合酶展开人工合成，这同样是一个巨大的难题。现有的天然或者是人工的RNA聚合酶，其持续合成的能力，也就是能够复制的RNA的长度，以及合成的速度，距离Taq DNA聚合酶的水准，相差甚远，很难高效地扩增长片段。倘若能够如同发现Taq酶那样，找到一种可以在体外稳定存在的RNA聚合酶，或者能够直接对该酶进行人工合成，比如说对天然的病毒RdRp进行改造或者加以利用，那将会是一项重大的技术突破。

3. 传统PCR/RT-PCR是一种扩增技术，它在变温循环，也就是变性、退火、延伸这个过程中进行，是基于DNA聚合酶的，其模板链是DNA，产物同样是DNA。RNA复制酶的工作模式是等温的，它直接复制RNA，模板链是RNA，产物还是RNA，它没办法参与以DNA为中心的PCR循环，这会面临保真度，也就是准确性问题，天然RdRp没有校对功能，错误率极高，是DNA聚合酶的万倍以上。其次，特异性跟引物设计同样属于一大难题，PCR的高特异性源自精心设计的DNA引物以及严格的退火温度。怎样处于等温条件之下，使RNA复制酶特异性地从复杂样本当中仅起始扩增目标RNA，而非复制非靶标RNA，这是一个巨大难题。

污染物耐受性，这同样是一个相当关键的棘手难题，PCR体系它历经了长达数十年时间的精心优化，所以对于样本当中所存在的杂质具备一定程度的耐受能力，然而全新的酶系统极有可能需要那种达到极其纯净程度的样本条件。

倘若能够成功克服上面所提到的那些问题，进而创造出直接以RNA模板链作为基础的RNA扩增技术，这般情况将会是一项意义重大的技术革新，毕竟在当初PCR技术模型刚刚问世的时候，根本就没有人能够想到它会发展到现如今如此成熟的地步。

倘若能够直接针对RNA链开展扩增，那么便能够达成等温反应，并不需要热循环，能够在几分钟迄半小时的范围之内完成扩增。或许不需要独立的逆转录步骤，设备进而能够做得极为小巧、便携且低成本。并且，直接检测RNA能够避免逆转录环节所存在的效率以及偏差问题。

以上，只是作者的一些思考，欢迎大家一起讨论。

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