一、PCR引物设计原则

1  引物长度一般在15-30bp。

引物的长度通常是在15bp至30bp这个范围之内，其中较为常用的是处于18bp至27bp之间，然而其可不应该大于38bp，这是由于要是过长的话就会导致它的延伸温度比74℃还要高，这样的情况是不适用于Taq DNA聚合酶来进行反应的。

2  引物GC含量一般为40%-60%。

对于引物而言，其GC含量通常处于40%至60%的范围之内，而以45%至55%作为适宜的数值标准，要是GC含量过高或者过低，那么对于引发反应而言都是不利的情况，上游引物以及下游引物的GC含量与Tm值需要保持较为接近的状态。

3  引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。

至少要在55至80℃之间，Tm值于72℃左右时可成就最佳复性条件dnastar引物设计，Tm值的计算存有多种方法，如依照公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件里运用的是最邻近法(the )。

4  引物3’端的碱基一般不用A。

引物位于3’端的碱基，通常不会使用A，鉴于A在发生错误引发的位点处，其引发效率相比之下是比较高的。

5，引物的3’端，出现了三个以上的连续碱基，像GGG或者CCC这样的dnastar引物设计，也会让错误引发的机率增加。

对6号，那种引物3’端的互补情况，还有二聚体现象，或者发夹结构，它们也都有可能致使PCR反应走向失败。

7、要是进行扩增编码区域的操作，那么引物3’端千万别终止于密码子的第3位，这是由于密码子的第三位容易出现简并的情况，进而会对扩增特异性以及效率产生影响。

8  引物5’端可以修饰。

PCR受引物5’端序列的影响不算特别大，所以常常会利用它来引入修饰位点或者标记物。

碱基要呈现随机分布状态，并且引物自身以及引物相互之间不能存在连续四个碱基的互补情况。

引物序列于模板内理应不存在相似性较高的情况，特别是 3’端相似性较高那种序列，不然极易致使错误引发。有一种降低引物与模板相似性的办法是，引物里四种碱基的分布最好呈随机样态，不存在聚嘌呤或聚嘧啶的情形。引物自身不应该有互补序列，不然引物自身会折叠成发夹结构，进而使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻对引物与模板的复性结合产生影响。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。在那些引物之间，同样不应当存在互补性，特别是要规避3’端出现互补重叠这一情况，以此来防止引物二聚体（Dimer与Cross Dimer）得以形成。引物之间不可以存在连续4个碱基的互补。要是引物二聚体以及发夹结构没办法避免出现的话，应当尽可能让其G值不要过高（也即应当小于4.5kcal/mol）。不然的话，容易造成引物二聚体带的产生，进而降低引物有效浓度，致使PCR反应无法正常开展。

10，引物的ΔG值，最好呈现为正弦曲线的形状，也就是说，3’端的ΔG值比较低，然而，5’端以及中间部分的ΔG值，相对而言是比较高的。

ΔG值也就是自由能，体现出引物跟模板结合的强弱程度，通常情形下，引物的ΔG值最好呈现为正弦曲线形状，也就是说3’端的ΔG值没那么高，然而5’端以及中间的ΔG值相对而言比较高。3'端的ΔG值相对而言较低，并且绝对值不可以超过9，要是引物的3’端的ΔG值过高，就容易在错配位点形成双链结构进而引发DNA聚合反应。

11 核酸保守区内要设计并有着特异性的引物，引物跟非特异扩增序列之间，同源性千万别超过 70% ，或者不能有连续8个互补碱基同源。

二、Real Time PCR引物设计原则

实时荧光定量聚合酶链式反应所使用的引物，与普通聚合酶链式反应引物的设计要求存在差异，聚合酶链式反应是促使目的基因依从理论数值来实现扩增，对于非特异性反应以及引物二聚体有着严格要求。

Real Time PCR引物设计原则

1. 扩增片段的大小范围是，八十至一百五十个碱基对，尽量将其限制在三百个碱基对以内。

2. 长度：17-25 base

3. GC含量：40-60%(最好45-55%)

4. Tm值：两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值

5. 碱基在整体上不能过度偏向一方，在个别部分要防止出现GC含量过高或者AT含量过高的情况，尤其是3’端，要避免T与C连续出现，要避免A与G连续出现。

6. 3'末端的序列情况是，3’末端要防止出现GC丰富或者AT丰富的情况，3’末端的碱基最好是G或者C，3’末端的碱基要尽可能避免是T。

7. 互补性方面，引物内部要避免出现3个碱基以上的互补序列，两条引物之间同样要避免出现3个碱基以上的互补序列，并且引物3’末端也要避免出现2个碱基以上的互补序列。

8. 特异性：使用BLAST检索，确认引物特异性

9. 专门用于RT - PCR的引物，要尽可能地在Exon那里去设计引物，以此来对基因组DNA的扩增加以限制。

三、常用的引物设计软件

“”、“Oligo”、“NTI Suit”、“”、“Omiga”以及“”。

下面详细介绍一下 5.0的用法：

1、通过File下的New或Open载入需要设计引物的序列

2、进入到程序的引物设计窗口

3、点击，则出现新的界面

在新的界面之中，去设置你所需要进行设计的引物的相关一些参数，主要存在五个需要进行设置的地方。

首要之处在于抉择设计PCR引物，测序引物，以及杂交探针，倘若要开展PCR，那就选取首个“PCR ”。

第二个所在之处是搜寻的模式，通常情况下，我们进行搜索引物的时候是以对来进行搜索的，因而一般会选择“pairs”。

第三个地方，是正负链所处的区间，还有产物的大小长度，这要依据自身的需求来定，它跟实验目的有所关联，需针对具体的情况展开具体的分析。

第四个地方，是引物的长度，以及其所具有的正负波动值，通常来讲，引物长度处于18至27这个范围之内。

处于第五的位置上的那个地方是选择模式，通常所选择的是“”。在将上面所讲述的那些地方设置完毕之后按下“OK”键，于是就会跳转到新的界面。

4、点击“OK”，出现如下新界面

有这样一种情况，其显示结果是依据评估分数，从高到低朝着下方进行排列，通常会选取评估分数相对较高的那些结果。打分这一行为，乃是用于衡量引物质量的综合性参数，借助打分系统能够为对引物展开有效评估以及在引物之间进行对比选择来提供有成效的证据。倘若我们仅仅是要去找寻正向或者是反向的引物，那么就能选择“Sense”或者“Anti - sense”按钮。

5、点击评分高的结果，就可以显示引物的详细信息，如下图。

该图左上角的两个按钮

所分别代表的是正向引物以及反向引物。给出引物得分的是该图中间部分。给出引物位置的是该图中间部分。给出引物长度的是该图中间部分。给出引物Tm值的是该图中间部分。给出引物GC含量的是该图中间部分。给出引物自由能的是该图中间部分。给出正反引物是否形成发夹结构情况的是该图最下面的模块。构成二聚体情况的是该图最下面的模块。出现错配情况的是该图最下面的模块。存在引物之间二聚体情况的是该图最下面的模块。代表有的是红色。可进行点击。

我们能够瞅见那些结构所浮现的详尽信息，就像起始的位置，生成的自由能。

6、若是我们对于搜索得来的引物感到不满意，那么能够手动去调整引物的位置，与此同时还能够点击。

通过按钮来以对引物予以修改，如此图所示，我们能够进行增加操作，也能够进行删除操作，还能够进行修改碱基的操作，一直到寻觅到最为理想的结果。

7、最后将设计好的引物导出或复制出来。

四、推荐几款在线引物设计网站

1、  

http://.ut.ee//

一个广泛使用的PCR引物设计程序。

2、-BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/-blast/

有一种工具，它能在线设计专门用于聚合酶链反应也就是PCR的具有特异性的寡核苷酸引物，并且该工具还同时整合了与NCBI的Blast功能。

3、

http://..uni-.de//

提供一个在线的简并引物设计工具，基础是同源基因。

4、

http://www..nl/cgi-bin//.cgi

5、

http://.enzim.hu/?m=

特地推荐那种，专门被设计用来扩增高度冗余的经亚硫酸氢盐处理过的序列的引物。给出能够避免非特异性PCR产物的快速的ePCR方法。

6、Web

https://www..org/cgi-bin/web-

斯坦福大学提供的在线引物设计软件,酵母基因组数据库提供。

7、

http://www..de/

快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件。

下面就-BLAST的用法做一下介绍：

首先进入NCBI的-BLAST，

1、-BLAST的输入

- BLAST 的界面中涵盖和具备了 BLAST 的功能，所提交的界面主要是由三个部分构成，分别是 tem-plate （也就是模板区），the （即引物区），以及 check （特异性验证区）。

如下方图示，于“PCR”下方左侧的文本框之内，输入FASTA格式的序列，或者点击“选择文件”加以载入FASTA格式的文件。在右侧，便可设置正向引物以及反向引物的起始地方和终止地方。在“”那个模块当中，能够输入PCR产物的大小数值以及Tm值参数。要是你已经把引物设计好了，打算拿来验证引物的优劣情况，就可以在此处进行输入。

2、验证引物的特异性

于“Pair Para-”区域里头，去挑选设计引物或者验证引物之际的目标数据库以及物种。此步骤是具备一定重要性的。在这里给出了7种数据库：mRNA，s，nr，()，( )，, 还有( from all )。建议采用“ ”数据库；( from all )乃是NCBI染色体数据库的旧版本，现已不再予以推荐使用；能够运用自身的序列当作搜索数据库。当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库

以标准来进行引物设计之际，-BLAST能够设计出专门用于扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物，同其他的BLAST情况一样，点击底部的“ -ters”存在更多的参数设置。

3、结果界面

上图呈现的是引物的可视化结果，此结果能够显示出全部引物的起始位置、终止位置，还有基因的CDS区，以及外显子的位置等。

其次，-BLAST会给出每一个引物对相当具体的所有信息，也就是像下面这张图所呈现的那样。其涵盖了引物序列，引物长度，起始终止的精确位置，Tm值，GC的具体含量，自身互补以及3’端互补的详细状况，PCR产物的长度以及所处位置等等。其中，Self的值越小那就越好，Self 3'的值同样也是越小越好。

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