点击箭头“体外诊断IVD知识库”关注我们！ ！

荧光探针方法使用序列特异性荧光标记探针来测量产物。 探针方法的出现促使定量PCR技术的特异性较常规PCR技术大大增强。 目前比较常提到的有探针、FRET杂交探针（荧光共振能量转移探针）和分子信标。

探针法长期以来已被广泛应用，但有人认为这些技术依赖于Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 通常试剂厂家只校准Taq酶的聚合酶活性，不会同时校准Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 `对于核酸外切酶活性的校准，不同批次试剂之间的定量会存在差异。 另外，探针的熔解温度（Tm）仅要求低于60℃，这使得不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难以进行质量控制检查。

1. 实时荧光探针设计

总体原则：探针和质粒的选择应保守，因此必须找到100-200 bp的相对保守片段来设计质粒和探针。 即real-的扩增片段为50bp----150bp。 当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

设计探针和质粒时，请考虑在两条链上设计质粒和探针。 但需要注意的是，在该链上设计探针时，应接近同一条链上设计的质粒（即上游质粒）。 这样就可以保证在以后的扩增中，即使扩增不完全，也会有荧光信号的报告。 两者之间的距离优选为从探针5'端到上游质粒3'的1个核苷酸，但也可以重叠。

如果在原始序列中找不到合适的探针和质粒（1主要是探针与上游质粒的距离太远，但与下游质粒的距离比较短；2要求突变位点在探针的5'端也可以测量荧光信号，但在3'端），质粒和探针可以设计成互补序列。

另外，实时PCR中探针和质粒的Tm值低于正常PCR中质粒和杂交探针的Tm值。

2. 探头设计

探头设计的基本原则：

1.保守性：探针必须绝对保守，有时分型仅由探针决定。 理论上，如果存在核苷酸错配，可能不会被检查到。 如果找不到完全保守的片段，则只能选择具有一处核苷酸差异的片段。 并且这种不同的核苷酸优选位于探针的中间，对探针与目标片段的杂交影响较小。 两端最好不要有不同的核苷酸，因为两端不利于探针的杂交。 并且优选A或T，但不是G或A，因为A、T是官能团，并且G、A是三键。

2、探针宽度：探针的厚度最好在25-32bp之间，Tm值在68-72℃之间，最好70℃，以保证探针的Tm值高于质粒10°C，以确保探针在发射时先于质粒与目标片段结合。 因此，探针最好含有GC保守片段，以保证较高的Tm值。 如今，有 MGB 探测器。 TAMER后标记MGB可以使探针的Tm值更高。 虽然探针片段较短，但也能满足探针的Tm值要求（68-70℃）。

3.探针名称：应标明探针在基因组中的位置和粗细。

4.探针Tm值估计：Tm值可以用oligo或软件估计。 确保探针中的 GC 浓度为 30-80%。 应防止探针中出现多个重复的核苷酸，特别是应防止四个或更多的G核苷酸。

5.探头评估：使用软件中的软件，点击“日志”菜单中的“”，在“名称”中输入探头的名称和位置，按Tab键输入“”，将数据粘贴或输入到待分析的探针序列。 选择整个序列后，在“”菜单下，分析探针的二聚体。 弹出窗口告诉探针有多少个二聚体，并用dG值评估探针（一般给出最差的dG值，dG值越大理论上越好）。 在“”菜单“”下，解剖探头的头带结构。 弹出窗口会告诉您有多少个探针，并对这些探针进行评估。 在多重荧光PCR中，需要对多个探针进行“配对二聚体”分析。

6. 探针的5'端不能是G，因为虽然单个G核苷酸与FAM荧光报告基团羧基连接，但G可以猝灭FAM羧基发出的荧光信号，从而引起假阳性。

7、探针与质粒之间的位置：探针应靠近上游质粒，即探针应靠近同一条链上的上游质粒。 两者之间的距离优选为从探针5'端到上游质粒3'端的1个核苷酸，但也可以重叠。 需要保证探针5'端距离上游质粒5'端至少4bp。

喜欢：

探测

5' → 3' 5' FAM → 3' 染料

后序：

5'--3'

补充已发表序列

3'--5'

3'←5'

或者：

5'→3'

后序：

5'--3'

补充已发表序列

3'--5'

材质染色3'←MAF5'3'←5'

探测

探测

3. 质粒设计

1. 上下游质粒应保存

为了扩增出所需的保守片段，必须对保守的100-200个片段进行PCR扩增。 因此，质粒的选择也应该非常保守。 最好不要有不同的核苷酸。 如有必要，质粒 3' 端至少 4 个核苷酸必须完全保守。

在设计保守型质粒时，需要在已发表序列上找到保守且一致的区域，即在已发表序列的5'端，质粒的3'端至少有5个bp是保守的，并且在已发表序列的 3' 端 质粒位置在 5' 端寻找至少 5 bp 的保守性。

5'3'

后序：

5'--3'

3'5'

2. 上下游质粒的厚度和Tm值

上下游质粒的厚度通常在18-25bp之间，Tm值在58-60℃之间。 确保质粒中的 GC 浓度为 30-80%。 应防止质粒中出现多个重复的核苷酸，特别是应防止4个或更多的G核苷酸。 质粒的3'端优选不是G或/和C。质粒3'端的5个核苷酸中不应有2个G或/和C。

上游质粒应标记为F()，且位于基因组的位置和厚度； 下游质粒应标记为R（），并且应位于基因组的位置和厚度。 Tm值可以用oligo或软件来估计。 上下游质粒Tm值差异不应超过2℃，宽度差异不应超过4bp。

3. 质粒的评估

使用软件中的软件，点击“log”菜单中的“”，在“name”中输入质粒的名称和位置，按Tab键输入“”，粘贴或输入待分析的质粒序列。 选择整个序列后，在“”菜单下，分析质粒的二聚体。 弹出窗口告诉该质粒有多少个二聚体，并用dG值来评估该质粒（一般给出最差的dG值，理论上dG值越大越好）。 在“”菜单“”下，解剖质粒的头饰结构。 弹出窗口显示有多少个质粒，并评估质粒。 然后选择需要的上下游质粒，并在“pair”菜单下分析上下游质粒。 弹出窗口告诉质粒有多少个二聚体，并用dG值来评估质粒（一般给出最差的dG值，理论上dG值越大越好（dG值一般为负值） ，绝对值超过4.5kcal/mol容易造成质粒二聚体条带的形成，增加质粒的有效含量，使PCR反应无法正常进行）。 无需考虑质粒与探针之间的配对和头套结构，因为探针的Tm值非常高。

4、上下游质粒与探针的距离（上下游质粒的位置）

理论上，上游质粒的3'端距离探针5'端1-20 bp，最好是1 bp，最近上游质粒的3'端距离3'端4 bp探头的； 针之间有一定的距离，但需要保证下游质粒的3'端距离探针3'端至多15-150bp。 整个目标片段的厚度优选在50-150bp之间，最长不超过200bp。

5. 简并质粒的设计

为了能够同时扩增，虽然质粒位点有突变目标片段，但如果多个核苷酸出现的概率相同，就需要设计一个代表该位点多个核苷酸的简并体。 合成质粒时，在合成该位点时，不是添加1个核苷酸，而是同时添加以简并体为代表的多个核苷酸。 这样，实质上合成的质粒除了简并位置的核苷酸不同之外，是多个质粒。 但对于简并质粒，应考虑每个质粒的Tm值，保证简并subs代表的不同核苷酸的Tm值差异不超过2℃。 如果超过2℃，在保证质粒3'端相同的情况下，在Tm值较低的核苷酸质粒5'端添加几个核苷酸dnastar引物设计，使Tm值相同。 但此时并不是简并质粒，而是两个粗细不同、简并子位点核苷酸不同、但Tm值相同的两个质粒分别合成，最后等含量混合。

5'→3'

顺序：

'-/NNNNN-3'

RR

4. 实时多重 PCR 探针的选择

1、多重实时PCR有两个意义：一是选择保守的探针和质粒，并使用不同的色素标记探针，在检验时根据荧光的颜色来判断不同的产品。 另一种是选择保守的质粒，扩增不同厚度的目标片段，在反应中添加SYBRN色素，最后根据不同目标片段的Tm值判断不同的项目。

2.多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：同时作为探针，或同时作为MGB探针，或同时作为探针。

3. MGB探头的优点

A。 MGB探针较短（14-20bp），更容易找到所有测序序列的较短片段的保守区域。

b. 短片段探针（14-20bp）添加MGB后，Tm值会提高10℃，更容易满足荧光探针Tm值的要求。

4 MGB探头的设计原理

1) 探针的 5' 端阻止 G 出现。 尽管探针被酯化成单个核苷酸，但与报告官能团连接的G核苷酸仍然可以猝灭该官能团的荧光信号。

2）用软件评估Tm值，Tm值应为65-67℃。

3) MGB探针尽可能短，但探针厚度不超过13bp。

4）尽量避免重复的核苷酸，特别是G核苷酸，防止出现4个或更多的G重复。

5）原则上，只要MGB探针中存在核苷酸突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会形成荧光信号）。 因此，在进行SNP检查时，为了测量突变体，即MGB不与目标片段杂交，不形成荧光信号，而探针的目标片段形成荧光信号测量，探头尽量放置在中间1/3的地方。 注：为了满足上述要求的四个条件，探针的突变位点可以连接到3'端，但突变位点在3'端前面至少2个核苷酸（即必须确保探针核苷酸的最后两个核苷酸绝对保守）以进行SNP检查。 反之，如果要进行类似的检查，则应找到保守的片段区域，并且探针中不应有突变位点。 如果探针只有13 bp，则探针仍然不完全保守。 突变有好几个，突变位点也应该靠近探针的5'端，这样即使是突变，探针也能与目标片段杂交，形成荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使是突变也能实现突变的检测。

5、多重PCR中dnastar引物设计，多重PCR中质粒之间的相互干扰和探针之间的相互干扰分析

设计完每对质粒和探针后，重新使用软件中的软件打开保存在同一文件中的多重PCR的质粒文件，然后选择设计的多重质粒或成对选择设计的多重质粒。 探针后，在“pair”菜单下，分析上游和下游质粒。 弹出窗口告诉我们该质粒有多少个二聚体，并用dG值来评估该质粒（一般会给出最差的dG值，理论上dG值越大越好）。

6. 多个实时荧光PCR扩增片段的影响

最好每个多重扩增的目标片段具有相同的宽度，但宽度不应相差太大。

7.同一亚型明显分为几组，想要同时扩增整个亚型的质粒和探针设计策略。

先设计每个亚群的保守质粒和探针，然后将探针用相同的色素标记，这样在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告的却是同一个色素报告基因。

荧光标记探针测得的产物特异性较强。 该探针是荧光定量PCR中常用的荧光探针。 通常探针5′端荧光标记的复合物有FAM、VIC等。探针3′端荧光标记基团为TAMRA等。

八卦提醒：

”

扫码加入，所有会员均可免费阅读！ 解决工作中的一切烦恼！ ！ ！

推荐阅读

2.

3.

4.

5.

6.

7.

每晚都在这里

更新最关键的知识点

如有侵权请联系删除！