新型冠状病毒爆发后，早期诊断成为控制疫情的关键，荧光PCR技术成为首选的初筛检测方法。 目前核酸检测率仅为30-40%，检测试剂盒的灵敏度令人担忧。 本期推荐林敬忠博士从引物和探针设计的角度对试剂盒的敏感性进行分析，以飨读者。

1 简介

新型冠状病毒爆发后，早期诊断成为控制疫情的关键，荧光PCR技术成为首选的初筛检测方法。 截至目前，已有多家企业获得新型冠状病毒荧光PCR检测试剂的临床注册批件，已有近百家企业研发出类似产品。 近期，有不少声音反映现有的新冠病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度较低。 目前检出率仅为30-40%，且多次漏检。 业界对此进行了广泛的讨论，一致认为造成检出率低、假阴性率高的原因有很多，包括试剂盒的灵敏度、试剂盒原材料的质量、核酸检测的效率等。酸提取、仪器设备的质量以及操作失误。 等，但尚未系统分析试剂盒灵敏度低的原因。 作者认为引物和探针设计是决定试剂灵敏度的关键。 设计中的问题属于固有缺陷，很难通过优化试剂盒成分和调整实验条件来显着改善。

早期诊断的敏感性关系到新型冠状病毒疫情防控的成败。 同时，未来还将有大量企业申请该产品的注册审批，并最终投入试验市场，将对人们的健康产生深远的影响。 疫情发生后，世界卫生组织公布了多国设计的新冠病毒荧光PCR引物探针序列。 作者多年从事分子检测试剂的研发，尤其是荧光PCR技术。 新型冠状病毒疫情发生后，我们也进行了相关产品的研发。 我们发现世界卫生组织在不同国家发布的一些引物和探针设计存在明显缺陷。 本文以美国CDC设计的N基因引物探针为例，探讨荧光PCR引物和探针设计的基本原理，并提出一些建议供同行参考，避免走弯路和资源浪费，可以认为为抗击疫情尽自己最大的努力。 力量份额。

任何技术都有其优点和缺点。 从不同的角度，侧重点不同，或者使用不同的参数、算法或软件，结论也可能不同。 毕竟理论分析与临床样本检测的结果不一样。 产品的敏感性最终必须经过临床试验并满足注册检测要求。 本文观点难免有偏颇，欢迎批评指正。

2. 探针荧光PCR的基本原理

实时荧光PCR是一种实时监测特定核酸靶序列PCR扩增的技术。 探针法是实时荧光PCR中应用最广泛的技术。 其基本原理是在反应中添加一对特异性引物和荧光标记探针。 探针的 5' 端用报告荧光团标记，3' 端用猝灭荧光团标记。 当探针完好时，由于荧光共振能量转移（FRET）的作用，报告基团的荧光被猝灭基团吸收，发出与仪器采集波长不同的荧光。 无法检测到扩增信号，因此探针必须依靠 Taq 酶的 5'-3' 外核活性dnastar引物设计，引物与模板结合后，将已经与模板结合的探针切割成双链随着双链合成的进行，报告荧光基团从猝灭基团中逸出。 屏蔽以发射仪器应检测到的荧光信号。 常用的报告基团包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，猝灭基团包括TAMRA、BHQ等。

3. 利用探针法设计荧光PCR引物和探针

一些最基本的原则可以参考美国ABI（ ）3.0指南（表1）。

表 1：荧光 PCR 探针和引物设计指南（3.0，ABI）

根据我们的经验，最重要的参数包括引物探针位置、Tm值、发夹结构和二聚体。 下面以WHO公布的美国CDC的N基因引物探针（表2）为例详细讨论。

表2：美国CDC设计的引物探针序列

01

引物探针位置

引物和探针的设计原则中，最重要的是在保证特异性（避免假阳性）的同时，避免假阴性（漏检）。 因此，组内的序列（需要检测的）应该选择保守的（即尽量避免突变）。 或者使用简并序列）、组间的特定区域（控制序列）。 另外，为了获得最佳的放大效果，还应尽可能满足表1的基本要求。

以SARS和蝙蝠冠状病毒的N基因序列为对照，对新型冠状病毒的N基因序列进行测序。 从图1、图2、图3可以看出，美国CDC的设计中，除了第二组上游引物不具有特异性外，其余探针和引物的位置选择都是为了保留组内的特定区域。 第二组探针和下游引物位于特定区域，因此不会发生非特异性扩增。

图1：美国CDC 2019-nCoV第一组引物和探针的位置

图2：美国CDC 2019-nCoV第二组引物和探针的位置

图3：美国CDC 2019-nCoV第三组引物和探针的位置

第三组设计的探针N3P对2019-nCoV没有特异性（可以同时与蝙蝠冠状病毒结合）。 5'端的第二个位置设置为Y，这意味着T/C简并性。 它无法区分新型冠状病毒和蝙蝠冠状病毒。 和SARS病毒。 然而，上游和下游引物均对 2019-nCoV 具有特异性，可能不会产生非特异性（假阳性）扩增。

02

Tm值

探针法荧光PCR通常采用两步法，即94℃左右变性，60℃退火延伸。 因此，引物的Tm值通常设计为60±2℃，探针的Tm值为70±2℃。

图4：美国第一个设计的Tm值

图5：USCDC第二组N基因Tm值

图6a：USCDC N基因第三组Tm值，探针5'端第二条序列为C

图6b：USCDC N基因的第三组Tm值，探针5'端第二个序列为T

从图4、图5、图6可以看出，这三组设计中的Tm值基本满足表1的要求。第三组探针N3P 5'端的第二个序列设计为为 Y（T/C 简并）。 当为C时（图6a），探针N3P的Tm值稍高，但通过优化应该不会成为主要问题。

03

引物和探针的发夹结构

稳定的二级结构（二聚体或发夹）是降低引物和探针利用效率的重要因素，尤其是探针的发夹，很容易导致探针利用率降低，导致荧光信号低，影响检测灵敏度。 通常发夹的dG应控制≥-1.0（注：dG是用来衡量裂解二聚体或发夹所需能量的参数，二级结构越稳定，裂解所需的能量越大，dG越小）。

利用DNA Star软件分析了美国CDC设计的三组引物探针的发夹结构。 结果（图7）发现第一组下游引物N1R具有稳定的发夹结构（dG=-2.3kc/m），第三组探针N3P具有稍稳定的发夹结构（dG=-1.3kc/m）。 m)，其余引物和探针不具有稳定的发夹结构。

图 7：USCDC 引物和探针的发夹结构

04

二聚体

设计时dnastar引物设计，通常控制二聚体（自二聚体或配对二聚体）在dG>-5.0kc/m，优选dG>-3.6kc/m。 从图8所示的三组引物探针的自二聚体可以看出，第二组探针具有非常稳定的自二聚体（dG=-13.1kc/m），并且第二组上游引物N2F具有稳定的自二聚体(dG=-9.3kc/m)，第三组下游引物具有相对稳定的自二聚体(dG=-7.0kc/m)。

图9显示美国CDC的第二组引物探针具有相对稳定的配对二聚体（dG=-9.0kc/m）。 图10显示第三组有两个相对稳定的配对二聚体(dG=-10.1kc/m)。

图8：美国CDC基因引物和探针的自二聚体

图9：美国CDC第二组引物探针的配对二聚体

图 10：USCDC 第三组引物-探针配对二聚体

另外，当使用一管进行多重检测（多重PCR）时，即一管同时检测多个位点或多种病原体时，还必须考虑不同位点之间的引物探针配对二聚体。 例如，当第一组和第二组组合时（图11），第一组的正向引物和第二组的探针具有相对稳定的配对二聚体（dG=-8.3kc/m）。 当第一组和第三组组合时（图12），第一组的探针和第三组的正向引物具有稳定的二聚体（dG=-12.2kc/m）。 当第二组和第三组组合时，第二组的上游引物和第三组的上下游引物各自具有相对稳定的二聚体（dG=-7.0kc/m 图13）。

图11：美国CDC N基因第一组和第二组配对二聚体

图12：美国CDC N基因第一组和第三组配对二聚体

图13：美国CDC N基因第二组和第三组配对二聚体

综上所述，美国CDC设计的三套引物探针的位置选择和Tm值设计都比较合理，但二级结构也比较稳定。 第一组反向引物N1R具有非常稳定的发夹结构（dG=-2.3kc/m，图7）。 第二组探针的自二聚体非常稳定（dG=-13.1kc/m，图8），上游引物的自二聚体也比较稳定（dG=-9.3kc/m，图8） ），比较稳定。 配对二聚体较多（dG=-6.8~9.0kc/m，图9），引物和探针的利用效率会比较低。 第三组探针N3P具有相对稳定的发夹结构（dG=-1.3kc/m，图7），探针和引物值均具有相对稳定的配对二聚体（图10）。

4、结果判定

美国CDC对结果提出了意见，认为只有三个位点的扩增曲线同时超过阈值才能判断为阳性（图11）。

笔者认为，这一判断没有理论依据。 基于探针的荧光PCR除了一对特异性引物外，还具有特异性探针。 基于设计的非特异性扩增的理论概率非常小。 在新型冠状病毒的检测中，以美国CDC的第一组引物探针为例。 从图1可以看出，SARS病毒在上游引物处有3个bp的插入，无法扩增。 蝙蝠病毒位于上游引物。 有4个突变，探针有1个突变，下游引物有5个突变。 理论上，由于不匹配而检测到最接近的蝙蝠序列（误报）的概率为（1/4）10=9.-7。 如果出现假阳性，最可能的原因是交叉污染或气溶胶污染。 正确的判断应该是，如果上述三个位点至少有一个位点的扩增曲线超过阈值，则可以判断该病例为阳性。 目前市场上常见的荧光PCR检测试剂大多只使用一个位点。

五、结论与建议

引物和探针的设计原则中，最重要的是在保证特异性（避免假阳性）的同时，避免假阴性（漏检）。 因此，组内的序列（需要检测的）应该选择保守的（即尽量避免突变）。 或者使用简并序列）和组间特定区域（控制序列），同时最大限度地提高反应中引物和探针的利用效率。 作者认为参数的重要性是引物探针的位置、探针的发夹结构、探针与上游引物的相对位置、Tm值、引物发夹、二聚体。

笔者对WHO公布的7个国家设计的引物和探针进行了详细分析，发现它们都存在一定的缺陷，其中有的缺陷比较明显，主要体现在：

1）不具体（德国E基因、香港大学Orf1b基因）；

2）探针发夹结构稳定（中国疾控中心基因探针、德国SARS RdRP基因探针P1、香港大学N基因探针）；

3）引物和探针相对位置不合理（中国疾控中心的N基因、德国的E基因、香港大学的Orf1b基因和E基因（设计在反向链上）、日本的N基因）；

4）Tm值不合理（中国疾控中心的N基因和基因、德国SARS的RdRP基因和E基因、香港大学的Orf1b基因和N基因、日本的N基因、泰国的N基因）；

5）引物发夹结构稳定（美国CDC N基因第一组反向引物、香港大学Orf1b基因正向和反向引物、美国CDC N基因正向引物香港大学）；

6）引物探针的自二聚体稳定性（中国CDC基因反向引物、美国CDC第二套N基因探针N2P、德国E基因探针P1、香港大学N基因正向引物及探针）；

7）引物探针配对二聚体稳定（中国疾控中心的N基因、美国N基因第二组、第三组、德国E基因）。

作者认为不能使用具有稳定发夹结构的探针。 距离上游引物太远的探针扩增效率较低，难以通过优化提高效率，应尽量避免。 其他二级结构可通过添加 PCR 加速剂或添加过量组分（引物探针、Taq 酶等）来改进。 不理想的Tm值可以通过调整退火和延伸温度来改善，但上面设计的一些引物和探针的Tm值几乎相同，这是不合理的，应该避免。

事实上，新冠病毒的基因组与最接近的蝙蝠冠状病毒有4%的差异，与SARS病毒有20%的差异。 目前的数据显示，武汉新型冠状病毒内部的差异非常小，大约在10万点左右。 第三(3.3x10-5)，基因组或N基因和基因中有很多区域可以设计特异性、高效的引物探针，用于荧光PCR检测试剂的开发和应用。

科学技术面前没有真正的捷径。 科学设计引物和探针是开发荧光PCR检测试剂的基础，是保证试剂盒灵敏度和特异性的最基本要素。 为避免走弯路和资源浪费，建议业内厂商严格遵循荧光PCR技术引物和探针设计原则来开发新型冠状病毒荧光PCR检测试剂。

作者简介：林敬忠，博士加拿大多伦多大学博士，美国加州大学博士后。 深圳市海外高层次B类人才。 现任深圳市萨格诺生物科技有限公司首席科学家/总经理。曾任深圳市泰泰基因工程有限公司创始人/总经理、美国Lynx 高级研究员。

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