穆利斯这位美国科学家发明了PCR技术，这是一种在体外条件下，通过简化步骤来模拟DNA在体内复制过程的快速且大量扩增DNA的方法。这项技术因其卓越贡献，在1993年荣获了诺贝尔化学奖。在PCR过程中，以待扩增的DNA分子作为模板，利用与模板互补的寡核苷酸片段作为引物，在DNA聚合酶的催化下，依照半保留复制的原理，沿着模板链逐步延伸，直至新的DNA合成得以完成。

——Kary B.

PCR介绍

PCR 反应条件

1、PCR反应成分

（1）模板

a、形式 单、双链DNA均可

b、纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应

c、通常情况下，浓度保持在100ng/100µL左右为宜，若浓度过高，则可能引发非特异性扩增的增多。

d、完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物

（2）引物

a、设计 长度适当、避免二级结构和二聚体

b、完整性 避免反复冻融

c、当浓度介于0.1至1.0微摩尔每升之间时，若浓度偏高，则容易引发模板与引物的不正确匹配，从而降低反应的特异性；而若浓度偏低，则扩增得到的产物数量会相对较少。

（3）ddH2O

补足体系，pH值适当，避免污染

（4）反应

a、pH、盐离子、稳定剂、增强剂  b、提供缓冲环境

（5）Mg2+

该激活剂适用于DNA聚合酶，其浓度范围在0.5至2.5mmol/L之间。若浓度偏低，Taq酶的活性将受到影响，导致PCR产量的降低；而浓度过高，则可能导致非特异性反应加剧。

dNTP和EDTA等物质能够与负离子相结合，因此，在反应体系中，这些物质的浓度变化会直接影响到游离Mg2+的浓度。

（6）dNTP

a、通常情况下，浓度介于20至200微摩尔每升之间，且四种成分应保持一致。这种浓度是由扩增产物的长度所决定的。若浓度过高dnastar引物设计，容易导致错误碱基的掺入；若浓度过低，则会减少反应产量。此外，浓度还可以与镁离子（Mg2+）结合，从而降低游离镁离子的浓度，进而影响DNA聚合酶的活性。

b、避免反复冻融 （7）Taq DNA 聚合酶

c、在0.5至2.5单位/50微升的浓度范围内，酶的用量提升会导致反应的特异性降低；而酶量不足则会影响到反应产出的数量。

2、PCR反应循环参数

变性过程涉及将双链DNA分解成单链，这一步骤通常在-93至-95摄氏度的温度下进行，持续20至30秒。需要注意的是，若变性温度设置过低或解链不完全，这将是导致PCR实验失败的关键因素之一。

退火过程中，所需温度范围通常为40至60摄氏度，这一数值取决于引物的长度以及GC含量的高低；通常情况下，退火温度会设定为Tm减去3至5摄氏度。提升温度有助于降低引物与模板之间的非特异性结合；相反，降低温度则有助于提高反应的灵敏度。至于退火时间，一般维持在30至60秒之间。

温度控制在70至75摄氏度之间，通常设定为72摄氏度，因为温度过高会妨碍引物与模板的结合；延伸时间取决于扩增片段的长度，对于1kb以下的片段，1分钟的时间即可，但若延伸时间过长，则可能导致非特异性产物生成；然而，对于低浓度模板的扩增，则需要适当延长延伸时间。

循环的频次  主要受到模板DNA浓度的制约，通常在25至35次之间；若循环次数过多，则会导致扩增效率的下降，同时错误掺入的概率也会相应提升。

PCR 引物设计

引物的序列特征及其与模板的结合特异性是影响PCR反应结果的关键因素。

引物设计的首要准则是力求最大化扩增的效率和特异性，同时，还需尽力降低非特异性扩增的可能性。

1、设计原则

首先序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。

引物长度通常在15至30碱基对之间，常见的是18至24碱基对，但在进行长片段扩增时，引物的长度可能会增加到30至35碱基对。若引物过短，则容易导致错配。例如，一个仅12碱基对的引物在人类基因组中可能存在200个潜在的退火位点，而一个20碱基对的引物在人类基因组中存在的退火位点则减少到原来的1/400。较长的引物，长度在28至35碱基之间，它们通常被用于区分同源性较高的模板序列，或者用于诱导特定的突变位点。

GC含量通常在40%至60%之间，对于π引物序列而言，这个比例是适宜的；若含量过高或过低，均可能对反应的启动产生不利影响。同时，上下游引物的GC含量应尽量保持接近，避免两者之间的差异过大。

在构建引物序列时，应尽量减少形成发夹结构，尤其是3'端的发夹。同时，应避免引物之间形成二聚体，尤其是3'端前三个碱基之间不应出现二聚体。此外，应避免局部区域富含GC或AT碱基，3'端应避免出现连续相同的碱基，如GGG、CCC以及富含AT的区域。

在实验过程中，应尽量减少引物与模板序列的错配位点。若错配不可避免，则应尽量避免产物的生成。特别是引物的3'端，不应形成非特异性的结合。若引物的3'端出现三个或三个以上的连续碱基，例如GGG或CCC，这会增加错误引发的几率。

2、设计软件

PCR引物设计通常依赖计算机软件来完成。用户可以直接将模板序列上传至专门的网页，从而获得预设计的引物；或者，他们也可以在个人电脑上操作引物设计专用的软件。然而，引物设计并非仅凭软件就能完成，它还要求一定的专业知识和经验。

常用软件

.0 （自动搜索）*

（引物评价）

NTI Suit

Omiga

  （在线服务）

.0使用简介

访问-sbio.tmmu.com.cn网站的主页，进入下载中心，进行软件的下载与安装。

2. .0使用演示

.0使用步聚：

复制序列，执行粘贴操作，进入“文件”菜单选择“新建”，选择“DNA”格式，然后使用快捷键Ctrl+V，选择“AS is”选项。

2. >Serch>设置引物参数>OK

3. 搜索完成再点OK，选择合要求的引物序列。

4. Blast检查引物特异性，必要时重新设计。

.0评价引物方法

执行操作时，请先打开文件菜单，选择新建命令，接着创建一个DNA文件。然后，复制粘贴序列，使用快捷键Ctrl+V。在弹出的对话框中，选择“AS is”选项。

2. >S>Edit > Ctrl+V>>>OK

3. >A>Edit > Ctrl+V>>>OK

PCR 常见问题

1、无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因： 1.模板：含有抑制物，含量低

2.引物：错误、设计不当、降解、合 成纯化不好

3.反应条件：退火温度不合适、延伸 时间过短、循环次数较少

应对策略：首先，可以采取纯化模板的方法，或者选用高品质的试剂盒来提取模板DNA；其次，也可以考虑增加模板的使用量。

2.合成前检查、重新设计、换一管、 重新合成

3.梯度PCR、延长延伸时间、加大循 环数

2、非特异性扩增

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因：1.引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏高

5.退火温度偏低

6.循环次数过多

对 策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3.适当减少酶量

4.降低镁离子浓度

5.适当提高退火温度或使用二阶段温 度法

6.减少循环次数

3、拖尾

现象：产物在凝胶上呈smear状态

原因：1.模板不纯

2.不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg2+浓度偏高

6.循环次数过

对策：1.纯化模板

2.更换

3.适当减少酶量

4.降低dNTP和镁离子浓度

5.适当提高退火温度

6.减少循环次数

4、污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

操作需轻柔细致，以避免产生气溶胶污染；同时，需注意防止靶序列被吸入加样枪内部。

或溅出离心管外

b.试剂应先分装，然后低温贮存

c.能耐高温的试剂或耗材高压消毒

d.更换实验室或试剂、耗材

提高 PCR 特异性的方法

a、巢式PCR（Nest-PCR）

减少引入多个靶位点风险，鉴于该靶序列能与多组引物相匹配。

少。增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度。 提高困

难PCR（如5‘ RACE）特异性

      b、 递减PCR（ PCR）

在PCR的初始阶段，通过严格控制退火条件，提升了反应的特异性；同时，循环设置得相当精确。

在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后 每个循环

将温度降低1至2摄氏度，直至退火温度降至Tm 5℃以下。同时，确保达到最高特异性的目标。

的模板会被优先扩增，这些产物在随后的 循环中继续扩增占

据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程

度的方 法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等

c、热启动PCR（ PCR

热启动主要依赖于抑制一种关键成分，以延缓DNA的合成过程，直至……

当PCR仪达到适宜的变性温度时，一般会采用热启动Taq酶的方法；这种方法通常被称作热启动PCR。

除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最要的方法之一

d、PCR增强剂

甲酰胺、DMSO、甘油以及甜菜碱等物质均能作为PCR反应的增强剂使用。

可能的机制在于，通过增强高GC链的解旋作用，降低其熔解的温度，从而有利于引物的结合。

退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适

当。

RT-PCR （ -PCR)

采用将RNA逆转录（RT）技术与cDNA的聚合酶链式反应（PCR）技术相结合的方法。首先，通过反转录酶将RNA转化为cDNA，随后以得到的cDNA作为模板，进行目的片段的扩增合成。

实时荧光定量聚合酶链反应技术是当前从组织或细胞中提取目标基因以及针对已知RNA序列进行定性及半定量检测的最优手段。

RT

1、RT

• 反转录（ )

以RNA为模板，合成与其互补的DNA 的过程。

• 反转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶)

RNA指导的DNA聚合酶活性

2. RNA水解酶活性

3. DNA指导的DNA聚合酶活性

2、RT反应成分

（1）模板             组织或培养细胞RNA

引物类型包括：oligo dT引物、随机引物以及针对特定基因的特异性引物。

反转录酶包括AMV、M-MLV、Super-以及Quant等类型。

（4）RNA酶抑制剂

（5）底物     等浓度的四种dNTP

（6）反应环境     缓冲液（RT ）

3、RT 引物的选择

随机引物适用于处理那些较长或呈发卡结构的RNA，其特异性相对较低。

起始浓度范围为20µl 体系50-250µg。

b、Oligo(dT15-18)：这种引物适用于带有PolyA尾端的RNA分子，并且，其目标序列与PolyA尾巴之间的距离

polyA的位置在2kb范围内。其起始浓度介于20µl体系中的0.2至0.5µg之间。

特异性引物dnastar引物设计，与目标序列相匹配，属于反义寡核苷酸类别，非常适合用于目标序列的研究。

已知的情况，起始 浓度范围为20µl体系1pmol。

d、RT 反转录酶的选择

• AMV： 禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。

最适42-60℃。

•MMLV：  鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶

H活性较弱。最适37℃或42℃。

• Super - ：MMLV反转

录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换

成cDNA，最适 42℃。

• Quant ：全新高效反转录酶，

与RNA模板的亲和力强，对GC含量高的模板通读效果

好，质量稳定，最适37℃。

RT - PCR 方法

两步法    RT和PCR分开进行

一步法    RT和PCR同时进行

• 两步法与一步法RT-PCR比较

两阶段操作法，与单一步骤操作法相对，指的是一种分步骤进行的方法。

引物类型包括Oligo dT、随机引物以及GSP。

在PCR扩增不成功的情况下，有助于深入探究失败的原因；同时，该方法具有高特异性和高灵敏度。

各自在最佳状态之下实施，反应速度迅速高效；操作简便，污染发生的可能性较小。

•cDNA可长期保存

适用于mRNA表达水平检测，亦可用于病毒和病原菌的检测。

进行多种目的基因的检测，同时开展大量样品的分析工作。

半定量逆转录聚合酶链反应技术，与定性分析相对，是一种用于检测和评估目标核酸分子数量变化的方法。

RT - PCR 要素

确保RNA质量高——纯度需达到OD260/280在1.8至2.0之间；——完整性方面，甲醛变性胶电泳显示28S和18S条带需明亮、清晰，且28S条带的亮度至少是18S的两倍以上；——在分离过程中需严格防范RNase的污染；——选用活性高的反转录酶；——提升反转录酶的孵育温度；——降低基因组DNA的混入率。

RT - PCR 常见问题

1、无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因：a.RNA降解或起始量少

b.RNA含抑制成分

c.cDNA 5’端不全

d.目的基因在组织中不表达或表达量 太低

对策：a.分离高质量的RNA

b.使用高温逆转录酶

c.使用随机引物或GSP

d.尝试其它组织

2、非特异性扩增

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增

原因：a.基因特异性引物较差

b.模板与引物非特异性退火

c.Mg2+浓度偏高

d.RNA中有内源性或外源性DNA污染

e.形成引物二聚体

对策：a.重新设计引物

b.使用基因特异性引物进行反转录， 或采用 PCR

c.降低镁离子浓度

d.使用扩增级的处理RNA，并 用滤芯吸头，或者引物设

计跨 越内含子。

e.设计在3’断无互补序列的引

3、拖尾

现象：产物在凝胶上呈smear状态

原因：a.cDNA浓度过高

b.降解DNA时产生的寡核苷酸 的非特异扩增

c.PCR反应的引物过多

d.循环次数过高

e.退火温度过低

对策：a.减少cDNA使用量或增大稀释倍数

提取优质RNA样本，在进行引物设计时，需跨越内含子区域，以此确保避免基因组DNA的污染。

减低引物使用效率

c.优化PCR反应体系

d.适当提高退火温度

RT - PCR 应用

1、 获得目的基因

2、 RNA定性与半定量分析

实时PCR （Real Time PCR)

常规PCR技术主要针对PCR扩增后的最终产物进行数量和性质的检测。它无法精确测量初始模板的量，也无法对扩增过程进行实时的监控。而实时PCR则通过在PCR反应体系中引入荧光标记，借助荧光信号的累积变化来实时跟踪目标基因的扩增情况。这种方法通过Ct值与标准曲线的处理，实现对起始模板的定性及定量分析。

方法介绍

非特异性荧光标记： 1、SYBR Green：

特异性荧光标记：     2、：

3、 ：

方法1----SYBR Green法

工作机理

• SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位

• SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光

• 变性时，DNA双链分开，无荧光

在复性和延伸过程中，双链DNA结构得以形成，此时SYBR Green染料会发出荧光，处于这一阶段。

段采集荧光信号

优  点

  对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 

使用方便 ----不必设计复杂探针 

非常灵敏 

便宜

缺  点

该物质倾向于与多种非特异性双链DNA相结合，从而可能导致假阳性结果的出现，然而。

可以通过优化 反应条件改变，melt curve是 必需的

  不支持多重荧光设计

方法 2----

工作机理

  标记荧光的发夹探针

茎由相互匹配的序列构成，通常包含5至7个核苷酸形成的环状结构，这些环状结构与目标序列精确地互补，覆盖长度可达15至30个核苷酸。

苷酸分子以链状排列，充当分子信标；当荧光基团被激活并发出光子时，这些光子会被淬灭基团所吸收。

淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

优 点

  高特异性，对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一

  灵敏度高，低至1个拷贝的核酸也能检测出

缺 点

  只能用于一个特定目标

  设计困难

  价格比较高

方法3 ----法

工作机理

该水解型杂交探针与目标序列形成互补配对，其5'端带有报告基团。

例如，FAM™、VIC®、JOE™、NED™、CY3™、CY5™等。

Texas Red®等

b.3'端附有荧光淬灭功能团，例如TAMRA™或MGB。

(non-)等 • 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸

采集后，样本不呈现荧光反应；当R与Q分离时，则会显现荧光；随着DNA分子的每一次扩增，都会有一份荧光被释放出来。

该荧光信号，在循环反应中能够实现对Taq酶5′至3′的外切核酸活性的监测。

酸酶活性，可水解探针

优 点

 a.对目标序列的高特异性 

设计较为简略，与目标序列中的特定区域形成互补关系。

c.重复性比较好 

d.支持多重荧光设计

缺 点

a.委托公司标记，价格较高

b.不易找到本底低的探针

实时 PCR 在科研和临床上应用

• 定量        -DNA定量

-RNA定量

• 定性        -SNP分析

-基因型分析

-RNA变异分析

-熔解曲线分析

-阴阳性鉴定

实时 PCR - 定量数据处理介绍

1）绝对定量 检测起始模板数的精确拷贝数，通常用标准曲线。

a.至少5个不同浓度梯度的 标准品，浓度涵盖未知样本浓度

b.每个点3重复

c.加入NTC，检测可能的污染

d. 未知样本Ct值代入公式，得到起始浓度X0  2 5

对经过不同处理后的样本目标转录本进行相对定量分析，以明确它们之间基因表达水平的差异。

异。

相对变化值（ΔCT）——无需采用内参基因进行均一化处理——以质量作为衡量标准。

– 准确量化初始材料

在实现均一化表达的过程中，需考虑初始样本之间的差异，并以内参基因作为衡量标准，确保结果的准确性。

或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因

竞争PCR

竞争性聚合酶链反应（PCR）过程中，靶基因与参照标准同时在一个反应容器内进行扩增，通过这种方法，可以……

通过将考核标准与参照物进行对比，对特定靶DNA或RNA分子的相对浓度进行估算。

竞争PCR技术显著降低了不同反应管之间扩增效率的差异性。

竞争 PCR - 理论基础

在PCR扩增反应中，PCR产物的数量可以通过公式Y = A * (1 + R)^n来计算，其中Y代表产物总量，A代表起始模板的浓度，R代表扩增效率，n代表循环次数。若扩增效率保持不变，则产物量与起始模板浓度呈正比关系。对于具有相似基因序列的样本，若使用相同的引物并在相同的结合位点进行扩增，其扩增效率也将保持一致。在最终得到的混合PCR产物中，所分析的样本与对照底物的终产物之间的比例，直接揭示了它们在起始阶段核酸含量的相对水平。

多重 + 竞争 PCR - 优势

a.通量高：每个反应孔内可同时检测10个基因；

经济性：适用于大规模样本对多个基因进行同步检测，显著减少了实验所需的时间，提升了

实验效率。

c.检测分辨度高：可有效分辨低至15%的表达量差异；

d.重复性佳：当对已知的RNA浓度进行逐步稀释处理之后，我们将开展多项表达水平的分析研究。

线性关系好R2＞0.99；

精确度优良：目标与参照基因片段之间的序列与内对照基因片段的序列大体相同。

性， 保证终扩增产物真实反应初始模板量比，一个或多个参

照基因与检测 基因在同一管内反应，每个基因的表达量都利

用竞争性PCR进行精确 测定。

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