（miRNA）引物设计及过程原理说明

茎环引物法原理

茎环引物，是一种引物，它能够自身环化，这种引物长度约为45bp，下面是茎环引物的示意图：

茎环引物的使用流程：

第一步：在反转录这个过程当中，茎环逆转录引物，这是需要自行设计的，它会与miRNA相结合，之后进行反转录从而成为cDNA；

第二步：在qPCR的过程当中，茎环结构会被打开，两条引物会与打开之后的茎环结构相结合，其中一条与茎环引物之上的公共序列相结合，另外一条与相应的（需要自己设计的）miRNA序列相结合，其他的miRNA同样也能够使用公共引物。

其平均长度大概在23nt左右，因而miRNA引物设计跟常规引物设计有着极大差别，以下对整个miRNA引物设计的过程包括实验流程进行讲解，用以协助大家在各方面展开学习。

首先，先要做的是介绍一下 mirna 反转录合成 cdna 的过程，在这之前呢进行引物的设计

先拿经典颈环序列CGAC来加以介绍，做好打开软件的操作，操作file打开下拉菜单这一动作之后，再进行打开Enter New …这种行为，之后粘贴颈环序列，最后点击OK 。

颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。

选择颈环结构（鼠标点一下）；点击下拉菜单；选择 。

第一个发夹结构，是实验所需的结构，这个结构的 dG 等于负 20.4kc/m 。

接下来说明，与has-miR-122-5P合成cDNA对应具体的详细过程，进而去阐释讲解有关has-miR-122-5P，也就是UGU 。

将U转T，方便后面使用：TGT

的颈环结构引物，是这样的一种结构，它是把的3’端后6位碱基，进行反向互补操作，然后添加到经典颈环结构的3’端而形成的，(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授)。

has-miR-122-5P的后6位：

has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：

颈环引物序列：

5’--3’

查看形成的发夹结构（方法前面有讲）

看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子：

在含有反转录酶的情况下，并且是适当的条件下，miRNA会合成cDNA链，其颈环引物也会合成cDNA链：

查看cDNA结构：

我们知晓了，cDNA的合成进程，以及序列，与此同时，学习了，miRNA的反转录过程。

下面进入重头戏，教大家怎样去进行miRNA引物设计。首先，要是你前面所做的实验是芯片实验，那就在此再度查看核对一番，若进行的是测序实验，那就需要把miRNA的名字中3p或者5p以及其之前这个部复制到miRAN上检索完整序列；随后将获得的miRNA完整序列复制到一个excel表当中接着运用查找替换的操作把U改成T，一定要记清楚进行改换，不然的话，可不认U的.0。

为了后续引物设计能够更便利地进行，是以miRNA序列来构建引物的，因此需求把miRNA的cDNA的反向互补序列找寻出来 使用.0。

打开File下拉菜单；New；DNA 。

因为在正规的设计进程里面，不会一开始就把cDNA序列找寻出来，所以直接的操作流程是，先把miRNA序列括号里的U改成T输入进去，然后再输入颈环结构序列的反向互补序列。

复制微小核糖核酸序列，这其中的尿嘧啶要改成胸腺嘧啶；点击有着特定标识的序列框，运用组合键“Ctrl+V”来粘贴序列；挑选正向的序列。

复制，颈环结构序列，点击，.0序列框，使用，组合键“Ctrl+V”，粘贴，序列，选择，反向互补序列，输入 。

此时，cDNA的反向互补序列已然录入完成，接下来要开展的步骤是，于.0这个数值处着手引物设计。

在序列前面输入9个N，这是个人习惯，有人是6个或以上的A，还有人不输入就直接设计引物，因为miRNA序列太短dnastar引物设计，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在设计正向引物时，一般需要加入3至6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计。

2.点击框下的，开始设计上下游引物；

3.存在经典颈环结构，这自然就不能少了常用的下游引物，平时会使用，。与此同时还能够适当地在颈环序列里前后挪动碱基来设计下游引物；

下游引物是自动跳出的显示框中默认选择的，这正好符合先将常用下游引物输入的操作，下游引物相对比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。

5.点击框内的Edit，之后选择所有引物序列，接着使用组合键“Ctrl+V”，以反向输入的方式输入下游引物，随后点击OK。

依次点击，进行在其引物方面基本信息的分析，然后点击Prime，去寻找引物于序列之中的结合部位，最后点击OK，从而确定下游引物。

6.点击那个图示的上下游转换键，开始着手设计上游引物，再点击Edit 。

去除，前面的，九个，N；点击；点击，prime；查看，前面，不添加，序列，时的，上游，引物，状况，如何。

在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。

8.绝大多数的状况之下，在前面添加的序列是以GC作为主要成分的状况，并且在添加GC序列时，要是序列中间并没有以AT进行隔开的话，那么TM值上升所对应的比值是比较高的情况，相同的道理，是添加AT序列的情况。不想要出现GCGC、ATAT、GCCG、或者是连续4个不一样的核苷酸的情况，这些失误会造成引物评分降低的情况。个人是喜欢添加CGGGC、、A/等的情况。

9. 例如做出加入的操作，要在5’端进行加入，不要在3’端加入这种情况；然后去执行点击的动作；再点击prime这个选项；接着查看引物的长度，并且查看引物的TM值，当两者差不多了，这就可以了，不过当然不是全部都行了；还要进行查看引物的自身颈环结构，查看自身引物配对这种情况，其重要指标是dG，当然这里面还有其他要素，哈哈；下游引物不需要去查看了，因为它属于那种经典内容，呵呵；最后点击OK 。

再次查看一下引物对之间的匹配状况，进而开展对上游引物的修改工作，或者替换下游引物。有必要去点击比对框下方的All来查阅所有的匹配情形，呵呵，期望你能够明白的。

11. 想做好实验的同学，可在其中进一步查看引物对状况，因为这两款软件让人感觉有很大不同，例如中引物的Tm值，会比中底5.5度左右，自己可以试一下dnastar引物设计，同时中对5’端中的匹对情况比较放松，可用经典下游引物看一下，中有的dimer在更变或增减个被核苷酸时会不显示，需进一步查看完整的dimer。

最后再讲一下，这个文本所做的仅仅是针对最基本的miRNA引物设计予以说明，诸多的限制并未向大家阐述清楚，要是想开展实验的话能够联系生物公司让他们给予帮忙设计，或者寻觅比较靠谱的师兄去请教一下。

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