基本原理

聚合酶链反应，也就是PCR，它是一种体外特定核酸序列扩增技术，此技术模拟DNA的天然复制过程，由变性、复性、延伸三个基本反应步骤构成，它要根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，这两个引物分别与DNA的两条链互补配对。拿适量的寡聚核苷酸引物，跟4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的模板DNA分子相混合，历经高温变性（让DNA双链散开）、低温复性（使引物跟模板附着）以及中温延伸（合成新的DNA片段）这三个阶段的一回循环，DNA的量就能增加1倍，那么30次循环之后，DNA的量增加230倍。

典型的PCR反应体系和PCR的三个阶段

典型的PCR反应体系构成：

PCR的三个阶段如下:

涉及模板 DNA 的变性情况：当模板 DNA 经过加热到大概 94℃持续一定时间后，会致使模板 DNA 双链或者经过 PCR 扩增而形成的双链 DNA 发生解离，进而成为单链，以此让它能够与引物相结合，从而为下一轮反应筹备条件；关于模板 DNA 与引物的复性：当温度下降到约 55℃时，引物会和模板 DNA 单链的互补序列进行配对结合；有关引物的延伸：在 Taq DNA 聚合酶的作用下，DNA 模板 - 引物结合物，以 4 种 dNTP 作为反应原料，把靶 DNA 序列当作模板，依据碱基配对以及半保留复制原则，合成一条全新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。进行重复循环，先是变性，接着复性，然后延伸，这样就能获取更多的半保留复制链，并且这种新的链又能够成为下次循环的模板。

实验用品

1.材料

枯草芽孢杆菌 AS 1.398基因组DNA溶液

2.试剂

3.仪器

实验步骤

引物设计

于NCBI那儿进行(ALP)基因序列的查询，将subsp. str.168的碱性磷酸酶基因序列当作模板来设计引物。依据DNA序列以及所采用的表达质粒载体pET - 28a - c(+)的图谱，借助5.0软件设计了两对引物。在上下游引物之上分别设置BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，这两个不一样的限制性内切酶识别位点分别于引物里以下划线的形式标记出来。引物序列如下:。

上游引物:

5'--3'(BamHⅠ)

下游引物：

5'-TTTTT-3'(Hind Ⅲ)

基因扩增

用提取出来的基因组DNA当作反应模板哒，借助合成好的引物，针对编码ALF的DNA序列展开PCR反应来扩增哟。

以上所说试剂添加完毕之后，进行离心操作，时长为5秒钟以便使其混匀，往其上加入20微升石蜡油，使其覆盖在混合物之上，凭借这样去防止在PCR过程里样品之中水分出现蒸发的情况。

等到所有反映都终结告终之后，将PCR仪的温度设定设置成为保持于4℃的状态。反应结束完毕之后，各自分别取5μL利用、借由1%琼脂糖凝胶电泳实行检测查验，基因的长度大概约为。添加加入样DNA当作作为电泳使用。电泳结束完毕以后，在凝胶成像体系系统进行观察查看结果并且拍摄照片。

产物纯化

采用DNA纯化试剂盒进行纯化dnastar引物设计，具体步骤如下:

PCR完成之后，需把反应液从PCR反应管移至洁净的1.5mL离心管里，添加4倍体积并进行混匀处理。要把纯化柱放置于收集管内，将混合液转移至柱中接着室温放置2分钟。

(2)12000 r/min 离心1min。

倒去那收集管里的废液，接着把那颗纯化柱放置到同一个收集管当中，之后加入600μL ，再以12000 r/min的转速进行离心操作，时长为1 min 。

(4）重复步骤(3)一次。

(5)把收集管里的废液倒掉，把纯化柱放进同一个所是收集管内，以每分钟12000转的速度进行离心操作，时长为2分钟。

把3S柱放进另外一个1.5 mL离心管里头，于纯化柱膜的正中央添加30 μL TE，在37℃的环境下放置2分钟。

在转速为12000转每分钟的情况下进行离心操作，时长为1分钟，这么一操作之后，位于离心管当中的液体呢，就是已经回收得到的DNA片段了，它能够马上被拿来使用的；当然啦，也可以把它放置在零下20摄氏度的环境里保存起来，以便后续备用的呀。

注意事项

由于PCR反应灵敏度极高，所以为避免污染，用于该反应的0.2 mL的管必须是全新的，且没有沾染任何污染物质，同时也不能含有酶，用于该反应的吸头同样必须是全新的，且没有沾染任何污染物质，同时也不能含有酶，进行实验操作时要戴上一次性手套，并且操作最好尽可能在无菌操作台上开展。

⒉.对工具酶以及DNA样品进行使用时，操作务必是在冰浴的条件之下来展开的dnastar引物设计，当进行使用之后，要是存在剩余的情况，那就应当马上把它们放回到冰箱当中予以保存了。

3.应设含除模板DNA外所有其他成分的阴性对照。

可以将其改写为：4.引物所使用的浓度通常是在0.1到1.0 μmol/L这个范围，要是浓度过得高的话，就容易产生引物二聚体或者使非特异性产物有所增加。要是浓度过低呢，就会对效率造成影响。

5.首先，PCR产物需经过电泳鉴定，经过这样的鉴定之后，要去得到分子大小保持一致的目的条带，在得到目的条带之后，才能够再去进行PCR产物的纯化，完成纯化之后，接着进行回收 。

结果分析

对PCR产物的DNA凝胶电泳结果进行拍照并分析。

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