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通常，定量PCR实验流程为：目的基因搜索与比对→探针与质粒设计→探针与质粒合成→配置反应体系→反应参数→重复实验、优化条件→获取曲线数据、标准曲线对比→重复验证。

第一步：目标基因搜索和比对过程的第一步，可以利用NCBI序列等软件完成目标DNA或RNA的搜索和比对——这相信很多人在分析基因时都会这样做测序报告。 第一步要注意的是确保分析的序列在a（，即染色体某些区域中相邻DNA片段的重叠）内。

第二步：如果其他条件相同，那么这第二步——引物和探针的设计可以说是定量PCR成败的关键。 通过总结各方面经验，有以下基本原则：

一般原则：

*先选择探针，然后设计尽可能靠近探针的质粒。

*所选序列应具有高度特异性，并尽量选择二级结构最小的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，并会阻碍酶的扩增。 建议先检查二级结构。 如果二次结构无法阻止，则应相应提高固溶温度。

*扩增厚度不要超过400bp，最好在100-150bp内，扩增片段越短，越容易获得有效的扩增反应。 较短的扩增子也往往能确保一致的分析。

*GC浓度保持在20%~80%之间，含有GC的区域容易发生非特异性反应，导致荧光颜料分析中扩增效率下降，出现非特异性信号。

*为了保证效率和重复性，应防止重复的碱基序列，特别是G（不能有4个连续的G）

*质粒和探针相互配对检查以防止二​​聚体和发夹。

质粒设计原则：

*序列选择应在基因的保守片段中

*防止质粒本身或与质粒之间连续4次或以上配对，并防止质粒本身产生环状发夹结构

*典型的质粒长度为 18 至 24 个核苷酸。 质粒需要足够长以维持序列奇点并增加序列存在于非感兴趣序列位点的可能性。 而厚度小于24个核苷酸的质粒并不意味着特异性更高。 较长的序列可能与错配的序列杂交，从而增加特异性，但杂交速度比短序列慢，从而增加产量。

*55-65°C 时的 Tm 值（由于 60°C 时核酸外切酶活性最高），GC 浓度为 40%-60%

*质粒之间的TM差异可防止温度超过2°C

*质粒的3'端阻止使用核苷酸A，质粒的3'端阻止3个或更多连续的相同核苷酸

*为了防止扩增，质粒设计最好跨越两个外显子。

*探针技术要求片段宽度为50bp-150bp

*质粒末端（最后5个碱基）不能有超过2个G和C。

探头设计原则：

*探针的位置尽可能靠近上游质粒

*探针宽度应为15-45bp（最好是20-30bp）以确保结合特异性

* 检查探针的DNA折叠和二级结构

*Tm值为65-70℃，一般比质粒TM值高5-10℃（至少5℃），GC浓度为40%-70%

*探针的5'端应避免使用G胍甾醇——因为5'G会有猝灭作用，但即使裂解也会有猝灭作用。

*整个探针中，核苷酸C的浓度应明显低于G的浓度——高浓度的G会提高反应效率，此时应选择另一条配对链作为探针。

*为了保证质粒探针的特异性，最好在blast中检查一次设计的序列。 如果发现非特异性互补区，建议重新设计质粒探针。

MGB探头设计：

*探针的5'端阻止了G，虽然探针被酯化成单个核苷酸，但是附着在报告基因官能团上的G核苷酸仍然可以猝灭该官能团的荧光信号

*Tm值应为65-67°C。

*MGB探针应尽可能短，但探针的厚度不应超过13bp。

*尽量避免重复的核苷酸，特别是G核苷酸，防止4个或更多的G重复

*原则上，只要MGB探针中存在核苷酸突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会形成荧光信号）。 因此，在进行SNP检查时，为了测量突变体，即MGB不与目标片段杂交，不形成荧光信号，而探针的目标片段形成荧光信号测量，探头尽量放置在中间1/3的地方。

注：为了满足上述要求的四个条件，探针的突变位点可以连接到3'端，但突变位点在3'端前面至少2个核苷酸（即必须确保探针核苷酸的最后两个核苷酸绝对保守）以进行SNP检查。 反之，如果要进行类似的检查，则应找到保守的片段区域，并且探针中不应有突变位点。

如果探针只有13 bpdnastar引物设计，则探针仍然不完全保守。 突变有好几个，突变位点也应该靠近探针的5'端，这样即使是突变，探针也能与目标片段杂交，形成荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使是突变也能实现突变的检测。

第三步：找一家值得信赖的公司来合成质粒和探针。 通常，质粒合成你很熟悉，但价格相对实惠（尤其是近五年），而探针则相对昂贵。 通常Probe合成的价格在1000到5000元不等（不同的合成需要不同的价格）——而且这只是一个标价，序列合成的价格与质粒合成的价格基本相似。

步骤4、5、6：虽然通常的定量PCR反应体系与普通PCR没有太大区别，但唯一的区别是探针的添加。 另一个区别是逐步方法的区别。 其中，需要注意的是：

*扩增酶最好使用热启动酶

*质粒和探针的含量需要优化。 有人建议从50nM开始，在50nM-900nM之间优化，通常是200nM（注意探针需要避光保存）

*等量的Mg和酶也需要优化，酶的推荐反应含量为1.25-1.5U（50ul）

模板A的添加量一般在100ng以下。 由于不同类型的DNA模板富集的目的基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。 如果要进行-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步中用作DNA模板的RT反应液的量不应超过PCR反应液总体积的10% 。

此外，即使在质粒和探针设计之后，循环参数也已确定，有时需要优化。

步骤7：进行数据分析时，一般采用不同含量标准样品的Ct值，形成标准曲线，然后估计相对方程。 方程的斜率可用于检测PCR的效率。 对于 100% PCR 效率，理想的斜率为 3.32。

最佳标准曲线是在PCR扩增效率90%-100%的基础上构建的（100%是指每个循环后模板总量会减少到前一个循环的2倍）。 所有标准曲线的线性回归分析需要有较高的相关系数（R2≥0.99），这样实验过程和数据才算可信。

使用这个方程我们可以估计未知样本的模板的初始量。 大多数定量 PCR 仪器都配有软件，可以根据标准曲线手动估计未知样品的初始模板量。

基本技术有两种：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的进行选择。 绝对定量是指将未知样品与标准曲线进行比较分析。 通常，标准品是已知绝对含量的 DNA 样本。 需要注意的是，绝对定量分析的准确度是相对于标准品的准确度而言的。

相对定量是指两个或多个基因相互比较，结果是百分比，没有测量确切的数字。

另外，由于不同样品的反应过程存在一定的差异，因此不仅需要制作标准曲线进行定量，还需要设计表达水平相对稳定的内参基因来标准化结果。 β-肌动蛋白和甘油醛三乙酸酯酶（-3-、GAPDH）是两个比较常用的看家基因，此外还有、、β-、β-、等。

应该指出的是，该基因可能受到反应条件的影响。 在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的步骤，严谨的研究人员会对一系列内参基因的定量结果取几何平均值。 定量数据被标准化。

另一个问题是如何区分获得的数据的优劣。 关于扩增曲线，根据经验得出：

1、总体来看，曲线拐点明显，指数期显着，扩增曲线整体平行度优良，基线平坦且无爬坡现象，低含量样品扩增曲线显着处于指数阶段。

2、曲线指数期的斜率反映了扩增效率，斜率越大，扩增效率越高。 扩增效率越高，试剂灵敏度越好。

3、基线，图上的基线是阳性样本的扩增曲线，直线或稍有升高就是好的试剂的性能，阴性和阳性一目了然，不容易误判。 如果有上升趋势，可能会导致阳性样本的误判。

4、曲线之间的平行性很好，说明各个反应管的扩增效率相似，而外标定量是建立在每个管的扩增效率相同的假设之上的，所以扩增越相似效率越高，定量的重复性和准确性越好。 无论扩增效率是否相似，扩增曲线上的响应就是曲线的平行度。

5、低含量曲线指数周期显着，一方面不易出现假阴性、阳性误判，另一方面表现出较高的灵敏度。

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