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一般定量PCR实验流程为：目的基因搜索与比对→探针和引物设计→探针和引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验并优化条件→获得曲线数据并与标准曲线比较→重复确认 。

第一步：在目标基因搜索和比对过程的第一步dnastar引物设计，可以使用NCBI序列等软件完成目标DNA或RNA的搜索和比对——相信很多人在分析测序报告时都这样做过，而这一步需要注意的重要一点是要确保所分析的序列在内（即染色体某些区域中相邻DNA片段的重叠）。

第二步：如果其他条件一致，那么这第二步——引物和探针的设计可以说是定量PCR成败的关键。 通过总结各方面经验，有以下基本原则：

一般原则：

* 先选择探针，然后设计引物，使其尽可能靠近探针。

* 所选序列应具有高度特异性，并尽量选择二级结构最少的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，也会阻碍酶的扩增。 建议先进行二级结构检测。 如果二次组织无法避免，则应相应提高退火温度。

* 扩增长度不应超过400bp，最好在100-150bp内。 扩增片段越短，越容易获得有效的扩增反应。 较短的扩增片段也更容易确保分析的一致性。

* 保持GC含量在20%到80%之间。 GC丰富的区域容易发生非特异性反应，这会导致荧光染料分析中的扩增效率降低和非特异性信号。

* 为保证效率和重现性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

* 引物和探针相互配对，以避免形成二聚体和发夹结构。

底漆设计原则：

* 序列选择应在基因的保守片段中

* 避免引物本身或与引物之间形成4个或更多连续对，避免引物本身形成环状发夹结构

*典型引物长度为 18 至 24 个核苷酸。 引物需要足够长，以确保序列的唯一性并减少序列出现在非目标序列位点的可能性。 但引物长度超过 24 个核苷酸并不意味着特异性更高。 较长的序列可能会与错配的序列杂交，从而降低特异性，并且比较短的序列杂交得更慢，从而降低产量。

* Tm值为55-65℃（因为核酸外切酶活性在60℃时最高），GC含量为40%-60%

* 避免引物间TM差异超过2℃

* 避免在引物3'端使用碱基A，并避免在引物3'端有3个或更多连续的相同碱基。

* 为了避免扩增，最好设计跨越两个外显子的引物。

* 探针技术要求片段长度在 50bp 至 150bp 之间

* 引物末端（最后 5 个核苷酸）不能有超过 2 个 G 和 C。

探头设计原则：

* 将探针尽可能靠近上游引物

* 探针长度应为15-45bp（最好20-30bp）以确保结合特异性

* 检测探针的DNA折叠和二级结构

* Tm值为65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少5℃），GC含量为40%-70%

* 避免在探针5'端使用G鸟嘌呤——因为5'G会有猝灭作用，即使被切割仍然会有猝灭作用。

* 整个探针中，碱基C的含量明显高于G的含量——高G含量会降低反应效率。 在这种情况下，应选择另一条配对链作为探针。

* 为保证引物探针的特异性，最好对设计的序列进行blast验证。 如果存在非特异性互补区域，建议重新设计引物探针。

MGB探头设计：

* 避免探针 5' 端出现 G。 即使探针被水解成单个碱基，与报告基团连接的G碱基仍然可以猝灭该基团的荧光信号。

*Tm值应为65-67℃。

* 尽量缩短MGB探针，但探针长度不应小于13bp。

* 尽量避免重复碱基，尤其是G碱基。 应避免 4 个或更多 G 重复。

* 原则上，只要MGB探针中有1个碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不产生荧光信号）。 因此，在进行SNP检测时，为了检测突变体，即MGB不与目标片段杂交，不产生荧光信号，探针目标片段产生荧光信号进行检测，探针的突变位点应尽量放置在探头的中间1/3处。 地方。

注：为了满足以上四个要求，可以将探针的突变位点移至3'端，但突变位点至少位于3'端前面2个碱基（即最后两个碱基）进行SNP检测时必须保证探针的碱基绝对保守。 另一方面，如果你想进行类似的检测，你应该寻找保守的片段区域，并且探针中不应该有突变位点。

如果探针只有13 bp，则探针仍然不是完全保守的。 有多个突变，突变位点也应该靠近探针的5'端。 这样，即使存在突变，探针仍然可以与目标片段杂交并产生荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使发生突变也能检测到突变。

第三步：找一家值得信赖的公司来合成引物和探针。 一般引物合成大家都很熟悉，价格也比较便宜（尤其是近两年），而探针则相对贵一些。 一般来说，引物合成要便宜得多。 探针合成价格从1000元到5000元不等（不同的合成要求有所不同）——而这还只是标记的价格。 序列合成与引物合成基本相似。

步骤4、5、6：一般的定量PCR反应系统其实和普通PCR没有太大区别。 只需要添加探针即可。 另一个区别是分步方法。 需要注意的是：

* 扩增酶最好使用热启动酶

* 引物和探针的浓度需要优化。 有人建议从50nM开始，在50nM-900nM之间优化，通常是200nM（注意探针需要避光保存）

*同样，镁和酶量也需要优化。 酶的推荐反应浓度为1.25-1.5U（50ul）

A模板的添加量通常小于100ng。 由于不同类型的DNA模板含有不同的目的基因拷贝数，必要时可进行梯度稀释以确定最佳的DNA模板添加量。 如果要进行2-Step RT-PCR反应的第二次PCR扩增反应，第一步中用作DNA模板的RT反应液的量不应超过PCR反应液总体积的10% 。

此外，虽然循环参数是在引物和探针设计后确定的，但有时需要对其进行优化。

步骤7：进行数据分析时，通常使用不同浓度标准样品的Ct值来生成标准曲线，然后计算相对方程。 方程的斜率可用于检查 PCR 的效率。 对于 100% PCR 效率，理想的斜率为 3.32。

最佳标准曲线是基于PCR扩增效率为90%-100%（100%是指每次循环后，模板总数将增加到前一次的2倍）。 所有标准曲线的线性回归分析都需要较高的相关系数（R2≥0.99），这样实验过程和数据才能认为可信。

使用这个方程我们可以计算未知样本的初始模板量。 大多数定量 PCR 机器都配有软件，可以根据标准曲线自动计算未知样品的初始模板量。

有两种基本方法：绝对定量和相对定量。 研究人员需要根据自己的实验目的进行选择。 绝对定量是指通过将未知样品与标准曲线进行比较来对其进行分析。 一般来说，标准品是已知绝对浓度的DNA样本。 需要注意的是，绝对定量分析的准确度是相对于标准品的准确度而言的。

相对定量是指两个或多个基因相互比较，结果是一个比率； 没有测量到确切的数字。

另外，由于不同样品的反应过程存在一定的差异，除了制作标准曲线进行定量外，还需要设计表达水平相对稳定的内参基因来标准化结果。 β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（-3-、GAPDH）是两种常用的看家基因，此外还有18sr RNA、β-、β-等。

应该指出的是，这些基因可能受到反应条件的影响。 在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的步骤，严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均值来对结果进行量化。 数据是标准化的。

另一个问题是如何判断所获得数据的质量。 关于放大曲线，经验总结是：

1、总体来看，曲线拐点清晰，指数期明显，扩增曲线整体平行度优良，基线平坦无上升，低浓度样品扩增曲线指数期明显的。

2. 曲线指数期的斜率反映了扩增效率。 斜率越大，扩增效率越高。 扩增效率越高，试剂灵敏度性能越好。

3. 基线。 图上的基线为阴性样本的扩增曲线。 平坦或略微下降的曲线是良好试剂的标志。 消极和积极的价值观很明显，很难误判。 如果有上升趋势，可能会造成阴性样本的误诊。

4、曲线之间的平行性非常好dnastar引物设计，说明各反应管的扩增效率相近。 外标定量是基于各管扩增效率相同的假设，因此扩增效率越相似，定量的重复性和准确性越好。 更好。 扩增效率是否相似，通过扩增曲线图中曲线的平行度来体现。

5、低浓度曲线指数期明显。 一方面较少发生假阴性和阳性误判，另一方面表现出较高的敏感性。

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