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荧光探针法使用序列特异性荧光标记探针来检测产物。 探针方法的出现使得定量PCR技术的特异性远高于常规PCR技术。 目前比较常提到的有探针、FRET杂交探针（荧光共振能量转移探针）和分子信标。

探针法已被广泛使用，但有人认为该技术利用了Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 一般试剂厂家只校准Taq酶的聚合酶活性，并不校准Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 3`核酸外切酶活性校准，不同批次试剂会带来定量差异。 另外，探针的熔点温度（Tm）只要求高于60℃，这使得不同试剂盒的特异性参差不齐，难以做质控检测。

1. 实时荧光探针设计

总原则：探针选择必须保守，引物选择必须保守。 因此，必须找到100-200 bp的相对保守片段来设计引物和探针。 即实时PCR的扩增片段为50bp-150bp。 当找不到150bp的保守片段时，需要保证探针片段的保守性。

设计探针和引物时，请考虑在两条链上设计引物和探针。 但需要注意的是，在该链上设计探针时，应靠近同一条链上设计的引物（即上游引物）。 这样可以保证以后的扩增时，即使扩增不完全，也会报告出荧光信号。 两者之间的最佳距离是探针的5'端与上游引物的3'端相距1个碱基，但它们也可以重叠。

如果在原始序列中找不到合适的探针和引物（1）主要是因为探针与上游引物距离太远，而与下游引物距离较近； 2）突变位点必须在探针的5'端（也可以检测到荧光信号，但在3'端），引物和探针可以设计成互补序列。

另外，实时PCR中探针和引物的Tm值高于普通PCR中引物和杂交探针的Tm值。

2 探头设计

探头设计的基本原则：

1.保守：探针必须绝对保守。 有时，分类仅由探头确定。 理论上，如果一个碱基不配对，就可能检测不到。 如果找不到完全保守的片段，则只能选择有一个碱基差异的片段。 不同碱基最好放在探针中间，这样对探针与目标片段的杂交影响不大。 两端最好不要放置不同的碱基，因为两端不利于探针的杂交。 而且最好是A或T，而不是G或A，因为A和T是双键，而G和A是三键。

2、探针长度：探针长度优选在25-32bp之间，Tm值在68-72℃之间dnastar引物设计，优选70℃。 确保探针的Tm值高于引物的Tm值。 10°C，以确保退火过程中探针在引物之前与目标片段结合。 因此，探针最好是富含GC的保守片段，以保证较高的Tm值。 现在有MGB探测器。 TAMER后标记MGB可以使探针的Tm值更高。 即使探针片段较短，也能达到探针的Tm值要求（68-70℃）。

3.探针名称：应标明探针在基因组中的位置和长度。

4.探针Tm值计算：Tm值可以使用oligo或软件计算。 确保探针中的 GC 含量为 30-80%。 应避免探针中出现多个重复碱基，尤其是 4 个或更多 G 碱基。

5.探针的评估：使用软件中的软件，点击“日志”菜单中的“ ”，在“名称”中输入探针的名称和位置，按Tab键输入“”，粘贴或输入探针待分析 针序列。 选择整个序列后，选择“”菜单下的“自二聚体”即可分析探针的二聚体。 弹出窗口告诉探针有多少个二聚体，并使用 dG 值评估探针（通常给出最差的 dG 值。理论上，dG 值越大越好）。 在“”菜单“ ”下，分析探针的发夹结构。 弹出窗口会告诉您有多少个探针并评估这些探针。 在多重荧光PCR过程中，需要通过“配对二聚体”来分析多个探针。

6. 探针的5'端不能是G，因为即使FAM荧光报告基团连接单个G碱基，G也会猝灭FAM基团发出的荧光信号，导致假阴性。

7、探针与引物之间的位置：探针应靠近上游引物，即探针应靠近同一条链上的上游引物。 两者之间的距离优选为从探针5'端到上游引物3'端1个碱基，但也可以重叠。 确保探针的 5' 端距上游引物的 5' 端至少 4 bp。

喜欢：

探测

5' → 3' 5' FAM → 3' 染料

发布顺序：

5'--3'

互补的已发表序列

3'--5'

3'←5'

或者：

5' → 3'

发布顺序：

5'--3'

互补的已发表序列

3'--5'

材料染料 3' ← MAF5' 3'← 5'

探测

探测

3. 引物设计

1、上下游引物要保守

为了扩增所需的保守片段，必须对保守的100-200个片段进行PCR扩增。 因此dnastar引物设计，引物的选择必须非常保守。 最好不要有不同的基础。 如有必要，必须保证引物3'端至少4个碱基完全保守。

设计保守引物时，在已发表的序列中寻找保守且一致的区域。 也就是说，在已发布序列的 5' 端寻找 3' 端至少有 5 bp 保守的引物。 也就是说，在已发布序列的 3' 端使用引物。 发现的位置在 5' 端至少保留 5 bp。

5'3'

发布顺序：

5'--3'

3'5'

2. 上下游引物长度和Tm值

上下游引物长度一般在18-25bp之间，Tm值在58-60℃之间。 确保引物中的GC含量为30-80%。 应避免引物中出现多个重复碱基，尤其是4个或更多G碱基。 引物的3'端最好不是G或/和C。引物3'端的5个碱基中不应有2个G或/和C。

上游引物应标记为F()，及其在基因组中的位置和长度； 下游引物应标记为 R()，及其在基因组中的位置和长度。 Tm值可以使用oligo或软件计算。 上下游引物Tm值差异不应超过2℃，长度差异不应超过4bp。

3. 引物评价

使用软件中的软件，点击“日志”菜单中的“ ”，在“名称”中输入引物的名称和位置，按Tab键输入“”，粘贴或输入要分析的引物序列。 选择整个序列后，选择“”菜单下的“自二聚体”即可分析引物的二聚体。 弹出窗口会告诉你引物有多少个二聚体，并使用dG值评估引物（通常给出最差的dG值，理论上dG值越大越好）。 在“”菜单“ ”下，分析引物的发夹结构。 弹出窗口将告诉您有多少引物并评估引物。 然后选择需要的上下游引物，点击“”菜单下的“配对”，对上下游引物进行分析。 弹出的窗口会告诉你这对引物有多少个二聚体，并用dG值来评估这对引物（通常给出最差的dG值，理论上dG值越大越好（ dG值通常为负值），如果绝对值超过4.5kcal/mol，则容易导致引物二聚体条带的产生，降低引物的有效浓度，使PCR反应无法正常进行）。 无需考虑引物和探针之间的配对和发夹结构，因为探针的Tm值非常高。

4、上下游引物与探针的距离（上下游引物的位置）

理论上，上游引物的3'端距离探针5'端1-20 bp，最好是1 bp。 上游引物最近的3'端距探针3'端4 bp； 下游引物应靠近探针的 3' 端。 针之间有一定的距离，但要确保下游引物的3'端距离探针3'端至少15-150 bp。 整个目标片段的长度最好在50-150bp之间，最长不应超过200bp。

5. 简并引物的设计

为了同时扩增引物位点也有突变的靶片段，如果多个碱基以相同的概率出现，则需要设计一个代表该位点多个碱基的简并片段。 合成引物时，合成到该位点时，不是添加一个碱基，而是同时添加以简并体为代表的多个碱基。 这样，合成的引物本质上是多个引物，只是简并亚位的碱基不同。 但对于简并引物，必须考虑每个引物的Tm值，保证简并物代表的不同碱基的不同引物的Tm值相差不超过2℃。 如果温度超过2℃，在保证引物3'端相同的情况下，在Tm值较低的碱基引物5'端添加几个碱基，使它们具有相同的Tm值。 但这次不是简并引物，而是分别合成两条长度不同、简并亚位点碱基不同但Tm值相同的引物，最后等浓度混合。

5' → 3'

顺序：

'-/NNNNN-3'

RR

4. 实时多重 PCR 探针的选择

1.多重实时PCR有两层含义：一是选择保守的探针和引物，使用不同的染料标记探针，检测时根据荧光的颜色确定不同的产物。 另一种方法是选择保守引物，扩增不同长度的目标片段，在反应中添加SYBRN染料，最后根据不同目标片段的Tm值确定不同的项目。

2.多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时探针、同时MGB探针、或同时探针。

3. MGB探头的优点

A。 MGB探针较短（14-20bp），使得更容易找到所有序列序列的较短片段的保守区域。

b. 短片段探针（14-20bp）添加MGB后，Tm值会提高10℃，更容易满足荧光探针的Tm值要求。

4 MGB探头的设计原理

1) 避免探针 5' 端出现 G。 即使探针被水解成单个碱基，与报告基团连接的G碱基仍然可以猝灭该基团的荧光信号。

2) 使用软件评估Tm值。 Tm 值应为 65-67°C。

3) 尽量缩短MGB探针，但探针长度不应小于13bp。

4）尽量避免重复碱基，尤其是G碱基。 应避免四个或更多 G 重复。

5）原则上，只要MGB探针中存在碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会产生荧光信号）。 因此，在进行SNP检测时，为了检测突变体，即MGB不与目标片段杂交，不产生荧光信号，探针目标片段产生荧光信号进行检测，探针的突变位点应尽量放置在探头的中间1/3处。 地方。 注：为了满足以上四个要求，可以将探针的突变位点移至3'端，但突变位点至少位于3'端前面2个碱基（即最后两个碱基）进行SNP检测时必须保证探针的碱基绝对保守。 另一方面，如果你想进行类似的检测，你应该寻找保守的片段区域，并且探针中不应该有突变位点。 如果探针只有13 bp，则探针仍然不是完全保守的。 有多个突变，突变位点也应该靠近探针的5'端。 这样，即使存在突变，探针仍然可以与目标片段杂交并产生荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使发生突变也能检测到突变。

5. 在多重PCR中，多重PCR中引物和探针之间的相互干扰分析

设计完每对引物和探针后，重新使用软件中的软件打开同一文件中保存的多重PCR引物文件，然后成对选择设计的多重引物或成对选择设计的多重引物。 选择探针后，进入“”菜单下的“配对”，分析上下游引物。 弹出的窗口会告诉你这对引物有多少个二聚体，并用dG值来评估这对引物（通常给出最差的dG值，理论上dG值越大越好）。

6. 多重实时荧光PCR扩增片段的影响

最好每次多重扩增的目标片段长度相同，但长度不能相差太大。

7.同一亚型明确分为几组，但引物和探针设计策略是同时扩增整个亚型。

首先，为每个亚组设计保守引物和探针，然后用相同的染料标记探针。 这样，在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告是相同的染料报告。

使用荧光标记探针检测产物的特异性比较强。 该探针常用于荧光定量PCR。 一般探针5'端的荧光标记基团为FAM、VIC等，探针3'端的荧光标记基团为FAM、VIC等。 用于塔姆拉等

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