1：引物设计原则

(1)引物长度为17～25bp，扩增序列长度为90～150个碱基，GC含量为40～60％。

(2) Tm值为50℃至60℃，上游引物和下游引物的Tm值相差不能超过5℃。

(3) 引物序列A、G、C、T整体分布尽量均匀，不能有局部GC富集或AT富集(特别是3'端)，避免T/T的连续结构C 或 A/G。 避免单个碱基连续重复超过 4 次。

(4) 3'端5个碱基中G或C不能超过2个。

(5)避免引物内部或两个引物之间存在超过3个碱基的互补序列，避免两个引物之间3'端存在超过2个碱基的互补序列。

(6) 探针应尽可能靠近上游引物但不应重叠。

(7)引物设计完成后，使用-BLAST搜索确认引物的特异性。

2：探头设计原理

(1) 探针长度不应超过30bp。 理想情况下，15bp 可产生最佳特异性。

(2) 确保探针的Tm值比引物高5-10℃，在退火过程中会优先与模板结合。

(3)探针的5'端不能是G。当G碱基与FAM荧光报告基团连接时，G也可以猝灭FAM基团发出的荧光信号。

(4)探针应尽量避免二聚体或发夹结构。

(5)选择C多于G的链作为探针。 G多于C会降低反应效率。

(6)避免多个重复碱基的出现，特别是4个或更多的G碱基。

三：引物和探针设计工具

小编推荐的软件有：5、6、.0.1、、、等。

四：荧光基团和猝灭基团

当前的探针方法 qPCR 利用荧光共振能量转移 (FRET) 现象。 探针上有一对可以产生荧光共振能量转移的基团。 利用酶的裂解来改变两个基团之间的距离dnastar引物设计，最终使系统的荧光强度发生变化。

五：MGB探针和SNP分型检测

近年来出现的MGB探针在Taq-Man探针的3端添加了二氢环化的吲哚卟啉三肽（DPI3），可以插入DNA的小沟中，使得较短的探针更加高效。 TM 值增加了杂交反应的特异性。

当SNP分型检测探针出现碱基错配时，需要较大的热力学差异才能检测。 常规探针长度较长dnastar引物设计，单碱基错配对整体探针Tm的影响较小。 野生型和突变型探针区分效果差，灵敏度低，容易出现误判。 原则上，只要有碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不会产生荧光信号）。

6：MGB探头设计原理

(1)探头长度不宜过长。 一般来说，MGB探针长度在13-20nt之间。

(2)突变位点碱基应位于探针中间1/3处(将探针分成三等份，SNP位于中间)。 如果这个位置不合适，无法设计出优秀的探针，可以将SNP位置移至3'端，更靠近MGB组。 避免将突变位点放在最后三个核苷酸内。

(3)其余参考普通探头的设计原理。

7：多探头设计原则

(1)设计多重系统时，应注意所有目标基因的引物或探针的Tm值应接近。 引物的Tm值一般为55-60℃。

(2) 不同靶基因的探针选择不同的荧光标记基团，并选择发射波长之间穿透力最小的荧光报告基团，如常用的FAM、VIC、ROX、CY5等。

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