点击箭头“IVD知识库”关注我们！ ！

自20世纪90年代探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）的新技术不断涌现，但作为经典的定量PCR技术，探针技术仍然是许多实验研究者进行定量检测的首选。 这主要是因为与SYBR荧光染料相比，探针具有序列特异性，仅与互补区域结合，且荧光信号与扩增的拷贝数一一对应，因此特异性强、灵敏度高，且易于优化条件； 而相对于杂交探针来说，只设计一根探针，因此探针设计更便宜、更方便，也能完成基本的定量PCR要求。 当然，定量方法仍然需要探针的合成，这也给实验操作带来了挑战。

一般定量PCR实验流程为：目的基因搜索与比对→探针和引物设计→探针和引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验、优化条件→获取曲线数据、比对标准曲线→重复验证。

第一步：在目标基因搜索和比对过程的第一步dnastar引物设计，可以使用NCBI序列等软件完成目标DNA或RNA的搜索和比对——相信很多人在分析测序报告时都这样做过，而这一步需要注意的重要一点是要确保所分析的序列在内（即染色体某些区域中相邻DNA片段的重叠）。

第二步：如果其他条件一致，那么这第二步——引物和探针的设计可以说是定量PCR成功的关键。 通过总结各方面经验，有以下基本原则：

一般原则

* 先选择探针，然后设计引物，使其尽可能靠近探针。

* 所选序列应具有高度特异性，并尽量选择二级结构最少的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，也会阻碍酶的扩增。 建议先进行二级结构检测。 如果二次组织无法避免，则应相应提高退火温度。

* 扩增长度不应超过400bp，最好在100-150bp内。 扩增片段越短，越容易获得有效的扩增反应。 较短的扩增片段也更容易确保分析的一致性。

* 保持GC含量在20%到80%之间。 GC丰富的区域容易发生非特异性反应，这会导致荧光染料分析中的扩增效率降低和非特异性信号。

* 为保证效率和重现性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

* 引物和探针相互配对，以避免形成二聚体和发夹结构。

引物设计原则

* 序列选择应在基因的保守片段中

* 避免引物本身或与引物之间形成4个或更多连续对，避免引物本身形成环状发夹结构

*典型引物长度为 18 至 24 个核苷酸。 引物需要足够长dnastar引物设计，以确保序列的唯一性并减少序列出现在非目标序列位点的可能性。 但引物长度超过 24 个核苷酸并不意味着特异性更高。 较长的序列可能会与错配的序列杂交，从而降低特异性，并且比短序列杂交得更慢，从而降低产量。

* Tm值为55-65℃（因为核酸外切酶活性在60℃时最高），GC含量为40%-60%

* 避免引物间TM差异超过2℃

* 避免在引物3'端使用碱基A，并避免在引物3'端有3个或更多连续的相同碱基。

* 为了避免扩增，最好设计跨越两个外显子的引物。

* 探针技术要求片段长度在 50bp 至 150bp 之间

* 引物末端（最后 5 个核苷酸）不能有超过 2 个 G 和 C。

探头设计原理

* 将探针尽可能靠近上游引物

* 探针长度应为15-45bp（最好20-30bp）以确保结合特异性

* 检测探针的DNA折叠和二级结构

* Tm值为65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少5℃），GC含量为40%-70%

* 避免在探针的 5' 端使用 G 鸟嘌呤 - 因为 5'G 会淬灭，即使被切割仍然会发生淬灭。

* 整个探针中，碱基C的含量应明显高于G的含量——高G含量会降低反应效率。 在这种情况下，应选择另一条配对链作为探针。

* 为保证引物探针的特异性，最好对设计的序列进行blast验证。 如果存在非特异性互补区域，建议重新设计引物探针。

MGB探头设计

* 避免探针 5' 端出现 G。 即使探针被水解成单个碱基，与报告基团连接的G碱基仍然可以猝灭该基团的荧光信号。

*Tm值应为65-67℃。

* 尽量缩短MGB探针，但探针长度不应小于13bp。

* 尽量避免重复碱基，尤其是G碱基。 应避免 4 个或更多 G 重复。

* 原则上，只要MGB探针有1个碱基突变，MGB探针就会检测到（MGB探针不会与目标片段杂交，不产生荧光信号）。 因此，在进行SNP检测时，为了检测突变体，即MGB不与目标片段杂交，不产生荧光信号，探针目标片段产生荧光信号进行检测，探针的突变位点应尽量放置在探头的中间1/3处。 地方。

注意：

为了满足上面要求的四个条件，可以将探针的突变位点移至3'端，但突变位点距离3'端至少2个碱基（即探针的最后两个碱基）必须确保探针绝对保守）以进行 SNP 测试。 另一方面，如果你想进行类似的检测，你应该寻找保守的片段区域，并且探针中不应该有突变位点。 如果探针只有13 bp，则探针仍然不是完全保守的。 有多个突变，突变位点也应该靠近探针的5'端。 这样，即使存在突变，探针仍然可以与目标片段杂交并产生荧光信号。 另一种方法是设计简并探针，即使发生突变也能检测到突变。

小道消息提醒：

“增加联系人！

扫描二维码加入，所有会员均可免费阅读！ 解决您一切工作后顾之忧！ ！ ！

推荐阅读

2.

3.

4.

5.

6.

7.

每天都在这里

更新最关键的知识点

如有侵权请联系删除！